SP细胞分析与分选
研究背景
肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞，具有自我更新能力和分化潜能，是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源，肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点。由于组织及细胞存在巨大差异，到目前为止尚未找到肿瘤干细胞的特异性标志。1996年，Goodell等在小鼠骨髓中发现SP（Side Population）细胞，即Hoechst 33342弱染的细胞。利用流式分选技术将SP细胞纯化后发现，部分肿瘤（如乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤等）中SP细胞具有Cancer Stem Cells（CSC）特性。近年来，通过流式细胞仪分选SP细胞的方法在肿瘤干细胞研究中越来越受到重视，诸多顶级刊物如《Nature》等顶级杂志上已有大量SP细胞研究的文章发表。
流式细胞仪在该研究中起着关键作用。通过流式分选得到的SP细胞纯度可达98%以上，同时能保证较好的细胞活性，分选出的高纯度SP细胞可以用于后续的免疫标记及分子生物学研究。SP分选法为研究肿瘤干细胞提供了新的思路，并且越来越多的学者正在使用SP细胞来研究肿瘤干细胞的某些特性，它将会再研究表面标记不清的肿瘤干细胞方面发挥非常重要的作用，为以后靶向肿瘤干细胞治疗提供新的方法和思路。由于SP细胞在细胞群体中的比例极少，且染色强度与非SP细胞非常接近，因此，SP细胞的检测及分选对流式细胞仪提出了极高要求。
图14.流式细胞术检测SP细胞示例图
实验案例:
BD Aria系列智能型分选平台
图15 BD FACSAria II上375nm激光分析分选小鼠各特异细胞群中SP细胞群
BD Influx开放型流式分选平台
图16 BD Influx分析分选肿瘤细胞群中SP细胞群
结果讨论
利用肿瘤干细胞能够将荧光染料Hochest 33342外排，即基于干细胞对Hochest 33342拒染或淡染这一特性，通过具有紫外或近紫外激光激发装置的流式细胞仪就可以将这部分干细胞检测或分选出来然而SP分选法对样本制备和仪器配置要求都很高，在样本制备方面：SP细胞群含量一般都比较低，且SP细胞对Hochest 33342的拒染源于其中转运蛋白酶ABCG2的高表达，一旦由于外部因素的影响导致ABCG2蛋白酶失活就无法实现SP细胞的分选，因此SP细胞的制备要求极为严苛；在仪器配置方面，所用染料Hochest 33342决定了流式细胞仪一定要配备紫外或近紫外激光激发装置，而SP细胞群体的低含量要求仪器检测灵敏度和分辨率都一定要高，同时SP细胞群体的低含量也同时要求流式细胞仪在进行活细胞分选时一定要高速加高回收率。
BD公司的两个分选平台均能成功的分选出低含量的SP细胞，分选出的细胞在后期的培养和实验中表现出典型的肿瘤干细胞特征。同时可以保证分选后的细胞保持很好的活性，为后续实验奠定坚实的基础。
相关文献:
简介：在这篇文章中，研究人员用FACS Aria II的375nm 近紫外激光分析了肉瘤细胞的SP分型，证明了375nm 激光的FACSAria II完全可以实现SP侧群细胞的分析分选。（Human primary bone sarcomas contain CD133+ cancer stem cells displaying high tumorigenicity in vivo）
简介：这篇文章介绍了研究人员对大鼠骨髓细胞进行多次设门后，用BD FACSAria III的375nm激光分析分选出含量仅0.0025%的CD34KSL＋侧群细胞，并且在各种培养条件下均可见大量的细胞集落(见下图)，体现了用BD FACSAria III的375nm激光对SP细胞的分析分选的好效果，后续培养实验也直接证明了FACSAria III进行痕量细胞分选时的最佳生物活性。（Identification and Functionality of Adult Mouse Hematopoietic Stem Cell Side Populations after Enrichment on the BD FACSAria II Flow Cytometer Equipped with a 375-nm Near UV Laser
Reynolds S. et al. BD Bioscience. Application Note. June 2009）
简介：文献利用多种表面标志与SP方法相结合，寻找几种细胞系的辐射耐受性肿瘤干细胞特异性表面标志。在经过辐射之后的肿瘤细胞，其活性已经很弱，而经过Influx的高速分选后还可以继续培养并做后续实验，充分说明BD Influx不仅灵敏度高、分选纯度高，而且分选后的细胞仍然能保持很好的活性。（CD24-/low stem-like breast cancer marker defines the radiation-resistant cells involved in memorization and transmission of radiation-induced genomic instability
Authors：J Bensimon, S Altmeyer-Morel, H Benjelloun, S Chevillard and J Lebeau
Journal：Nature/Oncogene放这篇文章的PDF第一页)
简介：该实验用SP的方法分离猪角膜干细胞后，分析其SP细胞与非SP细胞的基因表达差异。该实验分选的SP细胞比例为0.8%，且后续的实验是对分选纯度要求极高的分子生物学方法，BD Influx的分选纯度值得信赖。（Title：Differential Gene Expression in the Pig Limbal Side Population: Implications for Stem Cell Cycling,Replication, and Survival放这篇文章的PDF第一页）
编辑: gaowei2010
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