单倍体胚胎干细胞系建立
研究背景
胚胎干细胞具有分化为各种细胞类型的多能性和体外不断扩增的能力。胚胎干细胞不仅是研究发育生物学的有力工具, 还可用于研究疾病的发生机制、药物筛选与药物研发等, 在临床医学上可用于移植治疗和治疗某些遗传疾病。由于胚胎干细胞来源于胚胎,在某些国家和地区受到宗教、道德和伦理的制约。近些年对于干细胞的获取方式已经成为了科学家研究的热点。
2011年剑桥大学科学家利用实验鼠的卵细胞，在世界上首次培育出了哺乳动物的单倍体胚胎干细胞，这项成果将会极大推动基因研究。包括人在内的哺乳动物都是双倍体，也就是细胞中有两套染色体，一套来自父方，一套来自母方。然而，双倍体对于基因研究来说，是个巨大困难，因为科学家很难确定动物的某一性状是哪一套染色体决定的。而单倍体细胞，如酵母，是遗传学研究的重要工具。自然状态下存在的单倍体细胞只有结构和功能均已特化的配子，包括卵子和精子。然而卵子和精子不能在体外进行培养，因此也不能对其进行基因操作。如果能够在体外建立哺乳动物的单倍体细胞系，将极促进哺乳动物遗传学及相关生命科学研究。研究人员已构建出小鼠单倍体胚胎干细胞，只含有一套染色体，而不是两套染色体。这种新的单倍体胚胎干细胞能够用于快速分析参与哺乳动物发育方面的基因网络(基因网络指的是不同基因需要相互作用共同完成某项功能，将这些相互作用的基因汇集起来就构成基因网络)。在基因组中引入随机突变，然后观察突变细胞的功能变化从而极大地改善人类对酵母和细菌中基因网络的理解。也可用于前向遗传筛选时的基因鉴定或利用单倍体胚胎干细胞产生纯合子突变文库。
2012年4月27日，国际著名学术期刊Cell发表了中科院上海生科院生化与细胞所李劲松研究组和徐国良研究组的一项合作研究，他们建立了来自孤雄囊胚的单倍体胚胎干细胞系，证明这些细胞保持了一定水平的雄性印记，进一步验证这些细胞能够代替精子在注入卵母细胞后产生健康的小鼠。为了获得单倍体的孤雄囊胚，研究人员采用了核移植的技术，即将卵母细胞的核通过显微操作的方法去掉，然后注入一个精子形成携带来自父本基因组的单倍体重构胚胎。这些胚胎在体外能够发育到囊胚，从这些囊胚中分离建立了单倍体胚胎干细胞系。
为了获得小鼠单倍体胚胎干细胞，研究人员采取的实验方法中有着至关重要的一项就是使用流式分析计算单倍体DNA含量并通过流式分类富集单倍体胚胎干细胞系。为了下游的遗传学和功能性实验的研究，通过流式分选富集后细胞的纯度及活性极为重要。
实验案例
使用流式细胞仪连续分选纯化得到
分选后细胞回测
图1 BD Aria分析分选单倍体干细胞系
结果讨论
此实验结果是使用BD FACSAria II成功进行单倍体胚胎干细胞的纯化分选。经细胞分选富集并纯化了单倍体细胞，在重复的分选实验中始终保证样本的高活性，才能完成下游遗传学及细胞功能性研究。除此之外在实验样本的制备方面也是十分重要的，既要保证单倍体DNA含量能够被准确测定并且在通过流式分类富集单倍体胚胎干细胞系的过程中，不能因为染料的毒作用对细胞活性和功能性造成损伤。
目前获得类似ES细胞多向分化潜能特性的多能干细胞的方法有：体细胞核移植、细胞融合、体外培养以及转录因子诱导等。剑桥大学通过激活实验鼠的未受精卵细胞，成功培育出了哺乳动物的单倍体胚胎干细胞。研究人员采取的方法过程如下所示：激活未受精卵→培养到胚泡期(blastocyst stage)→移除透明带(zona)和滋养外胚层(trophectoderm)，分离出内细胞团→内细胞团在培养基(2i培养基或 含有KSR的DMEM培养基)以及LIF中扩增从而获得胚胎干细胞系→流式分析计算单倍体DNA含量并通过流式分类富集单倍体胚胎干细胞系→单倍体胚胎干细胞系经过35次以上的传代扩增。
相关文献
简介：中科院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所研究人员采用了核移植的技术，即将卵母细胞的核通过显微操作的方法去掉，然后注入一精子，形成携带来自父本基因组的单倍体重构胚胎。这些胚胎在体外能够发育到囊胚，从这些囊胚中通过Aria流式细胞仪分离建立了单倍体胚胎干细胞系。
编辑: gaowei2010
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