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特异位点甲基化检测技术

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发布日期：2012-09-18 15:04 文章来源：丁香园
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关键词： 甲基化 技术专题 欧易生物 丁香通 丁香园 　 点击次数：


前面我们介绍了几种中高通量的甲基化研究技术，包括甲基化芯片，甲基化测序，那么得到的数据如何进行验证呢？或者说如果研究者仅仅只是想研究部分甲基化位点的话，又该采用怎样的技术，下面，我将集中介绍一些目前应用最广的一些特异性甲基化位点研究技术：

1 、门槛最低、应用最广泛的方法就是MSP(methylation-specific PCR)，只需要普通的PCR仪即可进行相应的研究。样品前期先经过亚硫酸盐处理，针对处理后的片段设计两对引物，一对扩增发生甲基化的片段板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测 位点不存在甲基化。该方法前期亚硫酸盐处理和后续的引物设计是关键，引物一般设计在CpG位点上，如果处理不好，很容易出现假阳性和假阴性。



2 、BSP(bisulfite sequencing PCR), 亚硫酸氢盐处理后测序,在焦磷酸测序出来之前一直被称为“金标准”。前期样品也是经过亚硫酸盐处理，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物构建文库，挑克隆进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。该方法优点在于扩增片段长(300-500bp)，能够得到单碱基精度的甲基化状况，但是需要挑选大量克隆进行测序。



3 、HRM（High Resolution Melt），高分辨率熔解曲线，是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点检测技术，主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方法。同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。



4、 Methylight，荧光定量法，此方法利用TaqMan 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸盐处理DNA片段，针对甲基化和未甲基化各设计一个探针，用不同的荧光标记，随后开展实时定量PCR。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号，根据荧光信号的比值计算甲基化水平。该方法适用于样本量大但是位点少的研究。


  


5 、COBRA(联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法)，DNA样本经亚硫酸盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶（BstUI）消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则 PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割；若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。

这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。


    


6 、Sequenom结合碱基特异性酶切(分子切割)和MALDI-TOF检测原理，可实现多重CpG的分析检测，同时具有DNA甲基化定量分析能力。

将待测DNA经过亚硫酸盐处理，DNA中未甲基化胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化修饰的胞嘧啶不变。通过PCR扩增过程引入T7-启动子序列，经T7 DNA聚合酶的体外转录过程得到各样本RNA产物。 经过碱基特异性酶切处理，得到RNA小片段，并用飞行质谱检测每个片段的分子量，最后 EpiTYPER程序完成数据的自动化处理并报告每个检测片段的甲基化程度。


      


7 、焦磷酸测序（Pyrosequencing），特异性片段甲基化研究"金标准"，样品前期也是经过亚硫酸盐处理，然后设计引物扩增出片段，将PCR产物上机检测，根据特定位点T/T+C的比值计算出甲基化的水平。该方法可以检测到单碱基分辨率，价格便宜，性价比高，但是由于技术限制扩增的片段较短(约60bp)，所以引物设计是实验成功的关键。

 

            

编辑: gaowei2010

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