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MTT实验原理、配制及波长选择

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发布日期：2012-09-25 16:04 文章来源：丁香园
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关键词： 细胞 细胞培养 技术专题 义翘神州 丁香园 丁香通 　 点击次数：


一、MTT实验原理

黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

二、MTT的配制

MTT一般最好现用现配，过滤后4??C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

配制MTT时用用PBS<ph=7.4>溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方:

Nacl 8g

KCl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

调ph 7.4

定容1L

三、波长选择

至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值，而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。

DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.

细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。

复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000－10000个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：18－24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。

一般为了实验的准确，每个浓度可以设5－6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之间误差较小。这和分析化学中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。
 

编辑: gaowei2010

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