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Transwell侵袭实验

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发布日期:2012-09-25 16:28 文章来源:丁香园
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关键词: 细胞 细胞培养 技术专题 义翘神州 丁香园 丁香通   点击次数:


1. 实验用品:

Fig6



① Transwell小室:

多种厂家可提供,论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很方便,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是非常贵,24孔板配套的小室,每个价格约130元,不推荐给大家。BD也有已包被好的,价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室,是论坛里比较常用的,好像是要自己铺胶,但据说每个小室成本只有40左右,应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格,具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格:coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8?m,用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格:Millipore的8?m的50个1760RMB,0.4?m的2000多,是一次性的。梅林战友提供的BD价格: 240RMB一块(6.5um,24孔,12instert),好像是没胶的。liguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是:corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求,都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很干净,用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法:用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10min×2。

因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列,膜很结实,擦不坏,可以反复用很多次,但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能重复用一次,真黑啊!很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的,大家可以试试。

victoh战友对Millipore公司的millicell有比较详细的讲解,链接如下:http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2082166_1.html

本人没见过,有兴趣的可以自己研究一下。

另外,根据论坛战友提供的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理。Transwell小室用过后,可把原来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,这样又可以用了,不过我没用过,有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法: trasnwell小室做一次后,将原来的膜去掉,重新泡酸,泡酒精,使用前照紫外,然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上,剪掉多余的边缘。再照紫外。

② 上层培养液:

上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2% BSA。

③ 细胞:

值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不必要的浪费,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,并不是笔小数目,还是小心为妙。

另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验。

④ 基质胶:

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的:Matrigel是BD公司生产的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格:BD公司的matrigel 1500左右。

如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了。

⑤ 下层培养液:

下层常用含5%-10% FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子,但个人认为,FBS仍是最合适的。

⑥ 细胞培养板:

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。

⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。很多战友认为这不是必须的,而且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为,如果培养时间很长(>24h),细胞还是会掉到下室里面去,所以有条件的话,最好还是在膜下层涂上FN。

另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。

2.步骤

2.1 Transwell小室制备

2.1.1 无基质胶Transwell小室制备

① 包被基底膜:

用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。

② 水化基底膜:

吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80?l (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300?l预温的无血清培养基,室温下静置15-30min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

2.2 制备细胞悬液

① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

② 消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2.3 接种细胞

① 取细胞悬液100-200?l加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200?l。

② 24孔板下室一般加入500?l含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

③ 培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并无明显抑制,但24h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟是由于侵袭被抑制引起,还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。

时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象

在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。

2.4 结果统计

检测穿过的细胞数有两种方法:

2.4.1 直接计数法

2.4.1.1 “贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图:

Fig7



通过给细胞染色,可在镜下计数细胞

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

② 染色:常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。

个人推荐采用0.1%结晶紫染色,这种方法有如下优势:(1). 不需要固定细胞,直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值,间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为,虽然经过准确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,以致细胞成堆,这种情况下就难以计数了,这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意,染色前要将膜风干,否则可能会染不上。

③ 细胞计数:我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照,把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存,但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。

取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3-5个视野,也有人用10个,都是随机选取,个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性,也会掺进人为影响,特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野,不是随机选择,而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。

Fig8



如图,蓝色部分表示膜的大小,白色圆形表示视野的大小,绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心部分。这样,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,这样得到结果是比较客观和准确的。

Fig9



2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数

由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上,而是掉进下室。如下图:

Fig10



2.4.1 间接计数法

间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的MTT实验是同样的原理。

2.4.1.1 MTT法

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

② 24孔板中加入500?l含0.5mg/ml MTT的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37℃ 4h后取出。

③ 24孔板中加入500?l DMSO,将小室置于其中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分溶解。取出小室,24孔板于酶标仪上测OD值。

2.4.1.1 荧光试剂检测

这类方法一般是与Transwell小室一起出售的,其原理与MTT法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。

2.4.1.1 结晶紫检测

上文已说过,这里不再赘述,原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点,就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。
 

编辑: gaowei2010

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