RNA干扰慢病毒稳定株筛选
小分子RNA干扰技术是一种特异性地阻断某些基因表达的研究手段，在肿瘤、病毒感染，遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体，由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞，容纳大的外源性目的 基因片段，免疫反应小等特点，现已成为转移目的 基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中，可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达，成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。目前研究表明慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。为建立细胞模型后续基因治疗提供有效的研究手段。
生博目前为客户筛选过几百种基因的干扰片断，并通过慢病毒得到几十种稳定细胞株。为后续研究基因治疗提供了有效依据。
BXXX1基因干扰稳定HeLa细胞株构建
第一部分：BXXX1干扰载体构建（载体pMagic 4.1）
siRNA设计：
| Marker | gene | Gene ID | TargetSeq | GC% |  |
| KD1 | BXXX1 | NM_XXX4 | GCCXXXXXXXXXXXXXGA | 47.4 | |
| KD2 | BXXX1 | NM_XXX4 | GGTXXXXXXXXXXXXXTAT | 52.6 | |
| KD3 | BXXX1 | NM_XXX4 | CCAXXXXXXXXXXXXXTTT | 52.6 | |
| KD4 | BXXX1 | NM_XXX4 | GCAXXXXXXXXXXXXXGAA | 47.4 | |
| pLVT4 | NC | TTCTCCGAACGTGTCACGT | 52.6 |
第二部分QPCR筛靶实验
Real-time PCR检测结果显示： HeLa细胞中，相对NC组， 四个靶点中，KD2，KD4对目的基因BXXX1的表达的敲减效率达到80%以上，KD3对目的基因BXXX1的表达的敲减效率也达到50%以上，都是有效靶点。
第三部分Western blot内源验证实验报告
Western Blot检测结果
样品说明:
M 为Marker；
1 CON为正常目的空细胞（HeLa）样品；
2 NC为正常目的细胞（HeLa），加阴性对照病毒感染的细胞样品（Negative Control）；
3 KD为正常目的细胞（HeLa），加RNAi靶点病毒感染的细胞样品（Knock Down）
从Western Blot结果可以看出，KD1，KD2靶点对HeLa细胞BXXX1的表达有敲减效果，为有效靶点。
第四部分：干扰慢病毒KD1.、对照慢病毒CMV-GFP-L.V.感染HeLa细胞株后筛选稳定株。
| HeLa | ||
| 白光组 White light | 荧光组 Fluoresce | |
| 稀释度 Day 3， 100× | ||
| Blank |  |  |
| KD1 MOI 10 |  |  |
| KD1 MOI 20 |  |  |
| CMV-GFP MOI 10 |  |  |
| CMV-GFP MOI 20 |  |  |
三、实验总结：
1、HeLa细胞感染KD1.慢病毒，MOI 10、MOI 20时毒性大，死细胞多。若只计活细胞，感染效率高，都超过80%。
2、HeLa细胞感染CMV-GFP-L.V.慢病毒，MOI 10、MOI 20时感染效率高，都超过90%。
3、传代培养后，最终筛选出HeLa- KD1 MOI 10稳定株，HeLa- KD1 MOI 20稳定株、HeLa- CMV-GFP MOI 20稳定株。
编辑: cq
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
