SMMC-7721 脾脏注射肝转移实验

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发布日期：2011-11-02 10:36 文章来源：上海生博
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关键词： 丁香园 生物专 生博 肝转移 实验报告 　 点击次数：

前言：

肝脏是各种恶性肿瘤易发生转移的脏器，为转移癌的多发部位之一。肿瘤均可经血行或淋巴途径转移至肝脏，常见的肝转移肿瘤多来自消化道，肺，胰腺，肾，及乳腺等部位。因此，用癌细胞在裸鼠体内建立肝转移模型，已经成为研究恶性肿瘤肝转移机制和抗转移治疗的主要试验方法。本实验根据客户要求，检测CAV基因在RNAi前后的转移特性变化。

材料和方法：

1. 瘤源：人肝癌细胞SMMC-7721细胞株，客户提供两株慢病毒感染以后的稳定株细胞，阴性对照组（SMMC-7721-NC）和RNAi组（SMMC-7721KD）。

2. 实验动物  10只BALB/c 裸小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供【 许可证号：SCXK（沪）2007-0005】  鼠龄6周，体重18-20g，雄性，SPF（specific-pathogen free）条件下饲养。

3. SMMC-7721慢病毒感染以后的稳定株细胞培养：SMMC-7721细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中(后调整到15%FBS)，在含5% CO₂ 的37℃ 的细胞培养箱中连续培养。待细胞长至对数生长期（70%-80%铺满盘底）时，用0.25%胰酶消化，收集5×10⁷个细胞，1 000 r/min 离心5分钟，弃上清，无血清DMEM培养基洗细胞，再次离心，加入少许无菌PBS将细胞混匀调成单细胞悬液，总体积至1.0ml。

4.  建立裸小鼠脾脏注射肝转移动物模型：裸鼠称重，随即分成2组，分别为SMMC-7721-NC组和SMMC-7721-KD组，每组5只。乙醚麻醉，术野皮肤用75%酒精消毒，裸鼠左上腹斜切口约1.0cm，用组织镊将脾脏从腹腔中轻轻牵出少许，用1ml注射器5号针头分别将SMMC-7721-NC细胞和SMMC-7721-KD细胞缓慢注入裸鼠脾脏，每只裸鼠注射细胞悬液0.1ml（5×10⁶/只），注射时间约3分钟，可见脾脏被膜肿胀，变白，注射后将脾脏轻轻送回原位。各组注射完毕后用75%酒精棉球压迫针眼2-3分钟，压迫止血并杀灭可能外渗的癌细胞，防治腹腔内种植转移，缝合伤口，手术操作过程要严格遵守无菌操作原则。麻醉清醒后SPF级别饲养。

5. 观测指标：注射细胞后45天断颈处死裸鼠后开腹测量肝转移情况，并肉眼计数肝转移肿瘤的数目。把各转移肿瘤分离出来，拍照（分组），各组标本用福尔马林固定，制成冰冻切片准备做免疫组化用。

实验结果：

第一次实验：

预实验采用SMMC-7721细胞株本身进行，结果显示SMMC-7721细胞转移性较差，术后27天只在脾脏表面有很小很薄的皮状肿瘤类似物出现，而阳性对照细胞HT29细胞成瘤和转移性都好，术后14天即可发现肿瘤；因此确定SMMC-7721细胞成瘤性和转移性都较差，同时确定正式实验将采取在注射稳定株细胞后45天断颈处死裸鼠检测各项指标，以便保证如果SMMC-7721细胞能够成瘤和转移，则一定可以被检测到。

正式实验于2009年9月27日启动，次日早晨发现感染慢病毒的SMMC-7721细胞稳定株在注射后，无论是NC组还是KD组，裸鼠都发生死亡，每组死亡个数超过实验数目的60%。剩余裸鼠状态随着观察时间延长，在未来的3-5天相继死亡。从手术角度讲，生博的技术工程师已经有5年多的小动物实验经验，类似的实验做了数千个以上，应该不存在手术失误的问题。为排除细胞问题，我们经过与客户讨论后，决定进行裸鼠皮下成瘤模型，以观察细胞毒性问题。经过这次预实验观察，在裸鼠皮下成瘤模型中上述感染慢病毒的SMMC-7721细胞可以完成成瘤（50%），但成瘤率远远低于SMMC-7721细胞株本身（100%）。在此基础上，我们推断是细胞在感染慢病毒以后会有一定的毒性作用，状态不佳,并且很有可能具有支原体污染。因此，在后续培养感染慢病毒的SMMC-7721细胞稳定株时，我们提高了FBS的浓度到15%，同时添加了Applichem公司的Myco-1和Myco-2支原体抗生素，清除原有的支原体污染。在调整细胞状态良好后，进行了第二次正式实验。

第二次实验：

NC1-A	NC1-B	NC1-C-L
		解剖未找到肿瘤
NC2-A	NC2-B	NC2-C-L
		解剖未找到肿瘤
NC3-A	NC3-B	NC3-C-L
		解剖未找到肿瘤
NC4-A	NC4-B	NC4-C-L
		解剖未找到肿瘤
NC5-A	NC5-B	NC5-C-L

编辑: cq

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