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SMMC-7721 脾脏注射肝转移实验

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发布日期:2011-11-02 10:36 文章来源:上海生博
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关键词: 丁香园 生物专 生博 肝转移 实验报告   点击次数:

前言:

肝脏是各种恶性肿瘤易发生转移的脏器,为转移癌的多发部位之一。肿瘤均可经血行或淋巴途径转移至肝脏,常见的肝转移肿瘤多来自消化道,肺,胰腺,肾,及乳腺等部位。因此,用癌细胞在裸鼠体内建立肝转移模型,已经成为研究恶性肿瘤肝转移机制和抗转移治疗的主要试验方法。本实验根据客户要求,检测CAV基因在RNAi前后的转移特性变化。

材料和方法:

1. 瘤源:人肝癌细胞SMMC-7721细胞株,客户提供两株慢病毒感染以后的稳定株细胞,阴性对照组(SMMC-7721-NC)和RNAi组(SMMC-7721KD)。

2. 实验动物  10只BALB/c 裸小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供【 许可证号:SCXK(沪)2007-0005】  鼠龄6周,体重18-20g,雄性,SPF(specific-pathogen free)条件下饲养。

3. SMMC-7721慢病毒感染以后的稳定株细胞培养:SMMC-7721细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中(后调整到15%FBS),在含5% CO2 的37℃ 的细胞培养箱中连续培养。待细胞长至对数生长期(70%-80%铺满盘底)时,用0.25%胰酶消化,收集5×107个细胞,1 000 r/min 离心5分钟,弃上清,无血清DMEM培养基洗细胞,再次离心,加入少许无菌PBS将细胞混匀调成单细胞悬液,总体积至1.0ml。

4.  建立裸小鼠脾脏注射肝转移动物模型:裸鼠称重,随即分成2组,分别为SMMC-7721-NC组和SMMC-7721-KD组,每组5只。乙醚麻醉,术野皮肤用75%酒精消毒,裸鼠左上腹斜切口约1.0cm,用组织镊将脾脏从腹腔中轻轻牵出少许,用1ml注射器5号针头分别将SMMC-7721-NC细胞和SMMC-7721-KD细胞缓慢注入裸鼠脾脏,每只裸鼠注射细胞悬液0.1ml(5×106/只),注射时间约3分钟,可见脾脏被膜肿胀,变白,注射后将脾脏轻轻送回原位。各组注射完毕后用75%酒精棉球压迫针眼2-3分钟,压迫止血并杀灭可能外渗的癌细胞,防治腹腔内种植转移,缝合伤口,手术操作过程要严格遵守无菌操作原则。麻醉清醒后SPF级别饲养。

5. 观测指标:注射细胞后45天断颈处死裸鼠后开腹测量肝转移情况,并肉眼计数肝转移肿瘤的数目。把各转移肿瘤分离出来,拍照(分组),各组标本用福尔马林固定,制成冰冻切片准备做免疫组化用。

实验结果:

第一次实验:

预实验采用SMMC-7721细胞株本身进行,结果显示SMMC-7721细胞转移性较差,术后27天只在脾脏表面有很小很薄的皮状肿瘤类似物出现,而阳性对照细胞HT29细胞成瘤和转移性都好,术后14天即可发现肿瘤;因此确定SMMC-7721细胞成瘤性和转移性都较差,同时确定正式实验将采取在注射稳定株细胞后45天断颈处死裸鼠检测各项指标,以便保证如果SMMC-7721细胞能够成瘤和转移,则一定可以被检测到。

正式实验于2009年9月27日启动,次日早晨发现感染慢病毒的SMMC-7721细胞稳定株在注射后,无论是NC组还是KD组,裸鼠都发生死亡,每组死亡个数超过实验数目的60%。剩余裸鼠状态随着观察时间延长,在未来的3-5天相继死亡。从手术角度讲,生博的技术工程师已经有5年多的小动物实验经验,类似的实验做了数千个以上,应该不存在手术失误的问题。为排除细胞问题,我们经过与客户讨论后,决定进行裸鼠皮下成瘤模型,以观察细胞毒性问题。经过这次预实验观察,在裸鼠皮下成瘤模型中上述感染慢病毒的SMMC-7721细胞可以完成成瘤(50%),但成瘤率远远低于SMMC-7721细胞株本身(100%)。在此基础上,我们推断是细胞在感染慢病毒以后会有一定的毒性作用,状态不佳,并且很有可能具有支原体污染。因此,在后续培养感染慢病毒的SMMC-7721细胞稳定株时,我们提高了FBS的浓度到15%,同时添加了Applichem公司的Myco-1和Myco-2支原体抗生素,清除原有的支原体污染。在调整细胞状态良好后,进行了第二次正式实验。

第二次实验:

裸鼠编号 整体动物开腹照片 肝脏转移肿瘤照片 各转移肿瘤分离后照片
照片编号 A组 B组 C组
NC1 NC1-A NC1-B NC1-C
NC2 NC2-A NC2-B NC2-C
NC3 NC3-A NC3-B NC3-C
NC4  NC4-A NC4-B NC4-C
NC5 NC5-A NC5-B NC5-C
KD1 KD1-A KD1-B KD1-C
KD2 KD2-A KD2-B KD2-C 
KD3 KD3-A KD3-B KD3-C 
KD4 KD4-A KD4-B KD4-C 
KD5 KD5-A KD5-B KD5-C

 

NC1-A NC1-B NC1-C-L
解剖未找到肿瘤
NC2-A NC2-B NC2-C-L
解剖未找到肿瘤
NC3-A NC3-B NC3-C-L
解剖未找到肿瘤
NC4-A NC4-B NC4-C-L
解剖未找到肿瘤
NC5-A NC5-B NC5-C-L

 

 

 

 

编辑: cq

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