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真核重组让研究更有价值

● 真核细胞本身的蛋白,尽量用真核表达,真核的表达环境使蛋白更有可能形成正确的结构,具备糖基化等修饰,更可能具有天然功能。而目前生命科学研究中,研究的模式生物大都为真核生物。


● 在真核细胞表达真核细胞的蛋白,折叠、修饰等方面更接近于天然蛋白,一般内毒素更低。这样试验过程才更接近真实的细胞活动。


● 如果你的运气足够好,发现你的实验结果可以为药物开发提供线索。恭喜你!如果你的实验是用真核表达的重组蛋白完成的,药企肯定会更感兴趣,因为这样的药物候选分子商业化风险更小。

血清使用问题的总结(图)

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发布日期:2012-02-17 13:07 文章来源:丁香园
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关键词: 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 培养基   点击次数:

六、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问:在进行心肌细胞原代培养时,需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用,我现在使用的是含血清10%的培养液,但近日看北医一个细胞培养的课件发现,有用1%血清培养液进行中止消化的,想问一下,1%的是否可以,效果是否有保证?这样确实能节省不少血清的。

答:关于心肌细胞元代培养的FBS问题:

(1)1%的血清完全培养基可不可以,得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全培养基效果都不太好,开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS,20%左右,但这就有出现另一个问题,在FBS完全培养基中,成纤维细胞呈优势细胞,须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长,纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶,只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用,有讲究:刚开始使用20%左右的高浓度的FBS,后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问:我胰酶的用量是0.08% ,并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊,难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗,还有,我的BRDU只用到48小时就不用了,因为担心其损伤太大,可以持续用多久呢?

答:我用10%FBS终止的,然后差速1h,然后还是用10%FBS的HG-dmem养的,没有用brdu,心肌细胞还是比较多和稳定的,我第3天就可以用,第2天晚上看就会有搏动。

七、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问:细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢?周围有人用PAA或Hyclone的,这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗?

答:如果是长得非常快得细胞如pa317,293,c6等恶性肿瘤细胞,一般得国产血清就可以,如果是原代培养的细胞,最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清,Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海(中美和资)不错。有些细胞(如:sf9,293还有其他一些元代细胞),用Gibco的比其他两种好很多,会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如:vero,MDCK,pk)四季青,Hyclone的小牛血清足矣!另外,Gibco的还要看产地。

2、问:最近要订一瓶胎牛血清,实验室之前都在用小牛血清,没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些?问过试剂公司,有两种:一种是PAA的(分普通级和优级),一种是Hyclone的(只有普通级,而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的,但看好多文献都用Hyclone的,公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好?

答:民海的效果还不错,要是不放心国产的,那就买进口的。进口的好多公司都有,新西兰产的效果一般。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问:四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别?培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些?

答:用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问:SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清?

答:我一直用GIBCO的1640,你可以买含HEPES的1*10L的包装,胎牛血清也是用的GIBCO,10%就行。请查阅: www.atcc.org

八、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问:有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染,以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体?

2、问:我也想知道,我用的血清中大部分都有噬菌体,它对细胞培养到底有什么影响?

暂无回答。

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=8985974&sty=3&keywords=%D1%AA%C7%E5

九、培养基血清浓度问题。

问:在1640里加血清时加多了,90ml里加了20ml血清,约为18%,以前都是加10ml的,查了网上多建议用10%-15%,有关系吗?

答:我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大,建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好,但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱,影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

十、问:MTT加药的时候加不加血清?加药时要用无血清的培养基吗?

答:我的药就是用含血清的培养基稀释的,不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用,无形中对细胞造了一个serum-free的模型,细胞在提内本来就是有血清供应,如果该药物都不能对抗,那该药物就没有什么临床价值了,这是我的理解。

十一、PC12细胞培养所用血清问题。

问:我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞,需要灭活的马血清,可现在买血清很困难,好像是海关有封锁,代理商这么说的,我原定购买的Gibco的horse surum,现在无法买到了,好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone,有一种Donor Equine serum是马血清吗?

答:Hyclone的Donor Equine serum可以用,我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的,100ml大概140元,具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外:我买了以后灭活的。

十二、AB血清的制备问题。

问:本人想从人的外周血中分离AB血清的,用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血,来之不易啊。

答:是AB血型人的血清吗?这种血清即没有抗A型抗原抗体,也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中,待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固,减少凝固时间。离心可在2500~3000rpm,10min,足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算,因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。

十三、Gibico的胎牛血清内是否含糖?

问:我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问,回答我糖浓度少于5μg/ml,因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科,结果却是:6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗?(另起茶水验尿事件?)检验科没有给我回答。

答:应该是不含糖的。请参照gibco的网站:http://www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差,我想可能是样本不一样,需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

编辑: cq

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