原代培养中成纤维细胞的抑制

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发布日期：2012-02-16 15:35 文章来源：丁香园
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 成纤维细胞 　 点击次数：

人胚嗅鞘细胞的纯化

取材于人胚嗅球的嗅鞘细胞在培养过程中有多种其他细胞，如来自血管、软脑膜等结缔组织的成纤维细胞,以及神经元、星状胶质细胞、小胶质细胞等。其中，成纤维细胞是嗅鞘细胞培养体系中最棘手的污染细胞，其分裂增殖和贴壁速度极快，远远超出嗅鞘细胞的分裂增殖和贴壁速度，且侵蚀面积大。这个特点与动物相似。用于动物嗅鞘细胞纯化的方法很多，有差速贴壁、化学药物法、梯度离心法、免疫亲和吸附法等。目前国内外大多采用阿糖胞苷来达到纯化的目的。但我们参考动物嗅鞘细胞的纯化方法，在不同时间加入1×10^-6－1×10^-9浓度的阿糖胞苷，每数量级分别培养10次。我们发现，与动物嗅鞘细胞培养过程中阿糖胞苷纯化效果较好相比，人胚的嗅鞘细胞用阿糖胞苷纯化效果极不理想，且嗅鞘细胞数目大大减少。故试验中，我们放弃了阿糖胞苷纯化的方法，而采用了差速贴壁＋免疫亲和吸附的纯化方法。根据胎龄的不同，把含有嗅鞘细胞的培养基在CO₂培养箱(5%CO₂,37℃)中培养12－24小时。培养过程中，每2小时相差显微镜下观察一次。如观察到较多的立体感较强的细胞开始贴壁时，立刻将含有未贴壁的细胞的培养基接种到预先用P75抗体包被的35mm²培养皿内，放入CO₂培养箱(5%CO₂,37℃)中继续培养。培养36－48小时换液，祛除未能和P75 抗体结合的细胞。

人胚嗅鞘细胞的免疫细胞化学染色及免疫荧光染色及嗅鞘细胞纯度检测

用于嗅鞘细胞免疫染色的抗体较多，有胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，p75 NTR等，因本培养皿预先用p75抗体包被，故选用GFAP（1：1500）抗体进行免疫染色。成纤维细胞不能为GFAP抗体所标记，而嗅鞘细胞对GFAP标记较敏感且染色均一。所以GFAP免疫组化法可用于鉴别嗅鞘细胞和成纤维细胞。GFAP免疫组化法的缺点是不能区别OECs与其他中枢神经胶质细胞如小胶质细胞等，但前者从形态上（嗅鞘细胞的细胞有一个甚至多个突起，且突起十分细长）很容易与这些细胞区别出来。将培养好的嗅鞘细胞继续培养13d,分别在培养1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d弃掉上清，用0 .01MPBS清洗3次,接着用4%多聚甲醛固定30分钟，再用PBS清洗3次，0.3％双氧水处理10min,0.01MPBS清洗3次， Triton x-100洗30分钟，0.01MPBS清洗3次。滴加正常山羊的血清封闭液封闭20分钟后，甩去多余液体，不洗，加胶质纤维酸性蛋白(GFAP)羊抗血清，按ABC法进行免疫细胞化染色，同时进行免疫荧光染色，并设立空白对照和替代对照。将染色的细胞分别置于OLYMPUS倒置相差显微镜和OLYMPUS荧光显微镜观察，计数嗅鞘细胞的百分率。

免疫组织化学反应显示：带细长突起的单极、双极或多极的梭形细胞抗－GFAP，抗－nestin均阳性，可以确定这些细胞为嗅鞘细胞。成纤维细胞为GFAP反应阴性，神经元也呈GFAP阴性反应。虽然星状胶质细胞也为GFAP反应阳性,但从形态上容易区分两种胶质细胞。 

在治疗中枢神经系统损伤，需要大量的纯度较高的嗅鞘细胞，这是移植是否成功的基础。我们认为，由于成纤维细胞的生长速度大大快于嗅鞘细胞，所以，通过差速贴壁的方法，可以祛除大部分的成纤维细胞，而免疫吸附可以使绝大部分的嗅鞘细胞贴壁，免疫吸附后培养36－48小时换液,能祛除未能和P75结合的其他细胞。如：神经元、星状胶质细胞、小胶质细胞。此时获得的嗅鞘细胞是纯度比较高的。虽然近期文献报道[2]，一定数量的其它细胞，可促进嗅鞘细胞的作用。但这尚需进一步的研究。

在动物嗅鞘细胞培养的实验中，国内及大部分国外实验室都通过加入阿糖胞苷来达到祛除成纤维细胞的目的。但我们实验室通过分析不同时间点加入1×10^-6－1×10^-9浓度的阿糖胞苷培养结果，我们认为加入阿糖胞苷虽然可在短期内有效抑制成纤维细胞生长，但同时也抑制了嗅鞘细胞的生长，且在撤除阿糖胞苷很长时间后，嗅鞘细胞仍不能明显增殖。同时有可能残存的成纤维细胞由于失去了嗅鞘细胞高密度抑制从而迅速增生，使嗅鞘细胞纯度迅速下降。

p75是神经营养因子低亲和力受体,在嗅鞘细胞膜表面由跨膜、细胞外和胞质等三部分组成,其抗体能和细胞外部分发生特异性结合。因此,包被在培养皿上的p75抗体可以通过抗原抗体反应,在较短时间内将表达p75的嗅鞘细胞吸附在培养皿表面。而其它污染细胞由于缺乏p75，所以贴壁较慢。

人胚的嗅鞘细胞接种后，胎龄越小，贴壁所需时间越短。在有无血清的培养基中培养时，形态无明显差异。人胚的嗅鞘细胞较动物嗅鞘细胞生长快，且体积与突起长度均较动物的嗅鞘细胞大。因此，我们可以认为不同种属的嗅鞘细胞是有差异的。虽然表达有同样的物质，但也可能表达不同的物质。所有这些需要进一步研究。这对于最终的临床应用有着重大意义。

间充质干细胞

【flyingpumc】兔骨髓间充质干细胞的培养方法

兔骨髓间充质干细胞的提取、分离：取日本大耳兔10 只，4 个月龄，体重215～310kg。用2 %利多卡因于手术部位施以局部麻醉,在无菌操作下以骨髓穿刺针刺入兔髂骨骨髓腔，接5ml注射器，内含3000U/ ml 的肝素0.2ml，抽出骨髓4～6ml，经低糖的DMEM 稀释后，与Percoll 液( Pharmacia ,比重1.073g/ ml) 按1∶1 的比例进行梯度离心，928g 离心20min。离心后缓慢吸取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞至另一试管，以低糖的DMEM 洗涤两次，悬浮。

将上述分离所得单核骨髓细胞按2.0 ×10⁵ / cm²接种于含有10 %胎牛血清(FBS) 的HG2DMEM(含有青霉素100μg/ ml 、链霉素100μg/ ml ,pH7.2) 的聚苯乙烯一次性培养瓶内，于37 ℃，5 %CO₂  ，100 %饱和湿度条件下进行细胞箱培养。于72h 后除去非贴壁细胞，同时更换新鲜的培养液，以后每隔1 天更换新鲜的培养液，用倒置相差显微镜观察细胞形态及其生长变化并摄像，待细胞生长铺满至瓶底约90 %以上融合时，用0.25 %胰蛋白酶和0.01 %EDTA 消化贴壁细胞，取原代MSCs 进行相关的检测，同时按同样的密度进行传代。

兔骨髓间充质干细胞的传达培养:将传代的第P1 代、第P4 代、第P8 代间充质干细胞,按每孔2 ×10⁵个定量接种于24 孔培养板，次日起，每天取3 孔的细胞，经0.25 %胰蛋白酶消化后，作细胞计数，直至基本铺满整个瓶底。按3 孔细胞均数取点，绘制其生长曲线。传代培养过程中，隔日换液。

实验研究用Percoll (密度为1.073g/ ml) 梯度离心法加贴壁培养方法提取MSCs 既是简便的，又是实用的，与Ficoll (密度为1.077g/ ml) 梯度离心法相比，其比重较轻，能够在梯度离心时利用MSCs 与成纤维细胞比重不同，将MSCs 与成纤维细胞分离开；单层贴壁培养法又将不能贴壁的造血细胞分离开。

肝细胞

【yangqingdoctor】从胎鼠肝中获得的细胞培养后发现成纤维细胞特别多，而肝细胞较少，请问有什么办法可以很好的去除成纤维细胞，percoll离心可以吗，具体怎样？

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大，还是贴壁，请问为什么,怎样处理?

【huangxianzi】

1、试试看肝细胞专用培养基，如Gibco的Hepato－ZYME，可有效去除杂细胞。

2、还可试试梯度贴壁法，因成纤维细胞贴壁比肝细胞快，因此培养1小时后，换瓶，再重复一次，看看有无效果，但操作过程中，注意温柔一些，因肝细胞在体外很难培养。

liubo4210482sin培养平滑肌细胞中，出现了很多的成纤维细胞，请问有什么好的办法可以分离出它们???

有人说，用胰酶消化以后,两种细胞贴壁有快慢：成纤维细胞贴壁快，平滑肌细胞贴壁慢，靠掌握时间将它们分离开。

上面的说法是否正确，那么消化后，(细胞贴壁过程中)该在多少小时以后将悬浮液转移，另外培养，才能得到比较纯的平滑肌细胞???

shawm

多准备几个培养皿，消化重悬后，你随时观察细胞，过一段时间取上清，转入另一个培养皿。可以反复多次转皿。你的平滑肌细胞在上清中，所以可以时间稍长一点，但别等到大部分细胞贴壁。

chaoyuan

1、差速贴壁法。成纤维细胞贴壁快，平滑肌细胞贴壁慢。

2、加入5-溴-2′-脱氧尿苷（5-Brdu），终浓度为0.1 mM ，抑制成纤维细胞生长。

编辑: cq

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