各类细胞培养小结

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发布日期：2012-02-17 17:34 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

大鼠皮层神经元原代培养

液体配制：

硼酸硼砂缓冲液：0.05M四硼化钠45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；

胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡盐液定容至100ml

所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干备用。

操作步骤如下：

1. 孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2.在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。

4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5. 将所收集的上清经200目筛网过滤。

6.过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。

7. 细胞计数，调整细胞密度按1.5×10⁵/cm²种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10^-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

『注意以下几点』

1.上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。

2.上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择 孕13d 左右的小鼠。

3.神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够！！

4.在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中最好还是用同一来源（厂家）的玻片。

5.如果有B27和neurobasal培养基，那么就方便了（不用加AraC）－－

1）把细胞悬液用（DMEM＋20％FBS）悬浮，种到培养皿上6－12h后，全量换成2％B27的neurobasal培养基，继续培养，3d半量换液。

2）把细胞悬液用直接用2％B27的neurobasal培养基悬浮接种。

3）可以用新生1d内的胎鼠皮层直接培养。

胶质细胞培养（astrocyte, oligodendrocyte）

取材及胶质细胞的混合培养

1.P2 SD大鼠经低温麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2. 剪碎组织成1mm³大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的离心管内终止消化液作用5min。

4.吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5.所得上清于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度按1.5×10⁵/cm²种入25cm²培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3d进行全量换液。

摇床振摇分离星形胶质细胞和寡突胶质细胞

培养至7～10天，换液后放入孵箱继续培养24h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280r/min摇动18h。此时寡突胶质细胞90％以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

分离培养悬液内的寡突胶质细胞

吸出悬液至离心管内950r/min离心10min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×10⁵/cm²种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。24h后换成DF12＋N2的无血清培养液，此后每三天半量换液1次。

瓶底星形胶质细胞的继续培养

25cm²培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks液洗2次后常规传代，以1.5×10⁵/cm²种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1次。

动脉粥样硬化患者VSMC的提取

实验材料：眼科剪刀1把 眼科镊子2把 1×PBS约200ml M199培养液 离心机 5ml小皿 10ml大皿

实验步骤：

1.在超净台内用10ml的离心管分装5ml的1×PBS（已高压灭菌）。

2.手术台上取患者发生动脉粥样硬化改变的病变动脉，分放入准备好的PBS中，拿回实验室在超净台中，无菌条件下剥去外膜，用手术刀片刮去内膜，留下中膜并将其剪成1×1mm大小组织块。

3.消化法：PBS清洗组织块后并将其转移入10ml的离心管，加入0.125％胰酶消化37℃30分钟，室温吹打100分钟或者振荡器振荡100分钟，待组织块变小且消化液变粘时，收集消化液配平以1500转/分钟离心10分钟后，收集细胞种植于预先加入M199培养液的5ml小皿中放入37度5％CO₂的培养箱中。

4.贴块法：PBS清洗组织块后移入已准备好的10ml大皿中，块间距为0.5cm，放入37度5％CO₂的培养箱中，3小时后，待组织块贴壁后，再加入2ml培养液后放回37度5％CO₂的培养箱中。注意：最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下，勿使组织块吹下。

5.随后每3天予以半量换液。

6.一周后可见组织块周围有细胞爬出，大约3周后80%融合。因本人系非细胞生物学专业人员，本细胞培养时间又很短，多次进行细胞传代未成功，还望有经验的专家指点。

膀胱平滑肌细胞细胞原代培养

1.麻醉后消毒，下腹正中切口于膀胱颈（结扎处远端约1~2cm）

2.严格无菌操作取出标本、手术台位于超净台旁

3.在超净台，40u/ml庆大霉素溶液中浸泡5分钟

4.生理盐水漂洗1次

5.D－hanks液漂洗1次

6.放入D－hanks液中，除去粘膜、粘膜下及浆膜

如果是Shame组兔，以10ml注射器抽取约8ml D－hanks液，于粘膜层下注射起泡后，剪去粘膜层，直接剪取平滑肌组织，弃浆膜层及其上未剪下之肌组织。

new: 如果是不全BOO兔，则可将膀胱剪成宽约0.5cm之条状，撕去粘膜层后，助手以一眼科镊将该组织一端固定，眼科镊与该组织垂直，并夹持整个横截面，术者同法夹持于附近，助手持第3把眼科镊提起肌组织，术者以手术刀锐性分离肌层；如此，向另一端推进，锐性分离肌条。

7.在超净台，取相当于0.5为X0.5 CM²肌块，室温下将其剪碎成1~2mm碎组织块

8.转移入离心管

9.加入D－hanks液(操作成功)　OR　Dulbecco

10.离心1000转/min，10分钟 离心半径13cm，弃上清

11.加入I型胶原酶（2mg/ml） 5mg,(II型胶原酶2mg/ml 5mg也可，但效果不如I型胶原酶)

12.不要加入DMEM为主要成分的培养液(否则胰蛋白酶失活)

13.转移入培养瓶中

14.4度下过夜孵育。

15.加0.25%胰蛋白酶

16.36.5度振荡消化15~30min,弃上清。(可省)

17.200目(74um)不锈钢网过滤。(可省)

18.转移入离心管，吹打后待可见物沉淀，吸尽沉淀（避免组织块培养法）

19.离心1000转/min，10分钟 离心半径13cm，弃上清

20.加培养液至10ml(ok)

21.转移入培养瓶中

22.CO₂恒温箱中培养

23.12h后收集未贴壁细胞并计数 

编辑: cq

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