转录组测序
常见问题及解答：
1. 转录组测序需要多少测序量？
由于转录组测序需要进行表达量的分析，因此不推荐使用覆盖度，在确定测序量时，我们以产生的reads数作为依据。转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。① 针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；② 针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。
2. 研究转录组的方法有哪些？转录组测序与其他方法相比有哪些优势?
目前研究转录组主要有三种方法，包括基于Sanger测序法的SAGE （serial analysis of gene expression）、LongSAGE和MPSS（massively parallel signature sequencing），基于杂交技术的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于高通量测序技术的转录组测序（RNA-Seq）。与另两种方法相比，RNA-Seq具有以下优势：① 高灵敏度，检测阈值跨越6个数量级，能检测到细胞中几乎所有的转录本，包括一些只有几个拷贝的稀有转录本，同时能对转录本进行定量；② 高准确率，能准确的测定每个转录本的单核苷酸，同时不存在生物芯片的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音的问题；③ 应用范围广，无需预先设计探针或了解物种的基因信息，即可对任意物种进行转录组测序，同时能发现新的转录本，预测新的基因，检测可变剪切、SNPs、融合基因等。
3. 转录组测序结果的影响因素有哪些？
转录组测序的影响因素主要包括以下几个方面：
1) RNA的降解会严重影响测序的质量：① 若RNA的3'端发生降解，则无法通过3'端的poly A捕获mRNA，反转录后进行测序也无法得到全部的cDNA；② 若RNA的5'端发生降解，通过3'端的poly A捕获得到mRNA，测序结果将出现明显的3'和5'偏向。
2) RNA起始量不足影响测序的质量：RNA起始量不足时，需要增加PCR扩增循环数才能获得足够的量用于后续测序，这会产生大量的冗余数据。
3) 文库中poly A多聚物的存在会对测序信号产生干扰，影响测序结果的准确性。
4) 由于转录组中基因的丰度不一致，高丰度的表达基因会掩盖低丰度的表达基因，导致寻找新基因失败或产生大量冗余数据。
编辑: helen
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