SILAC文献实例
文献解读：
Comprehensive mass-spectrometry-based proteome quantification of haploid versus diploid yeast. (Nature, 2008)
de Godoy LM, Olsen JV, Cox J, Nielsen ML, Hubner NC, Fröhlich F, Walther TC, Mann M. (2008) Comprehensive mass-spectrometry-based proteome quantification of haploid versus diploid yeast. Nature 455, 1251-4.
这篇文献是蛋白质组学现在的重要软件---MAXQUANT的第一次大规模应用，来自德国马普实验室的Matthias Mann教授，带领他的团队完成了对模式生物酵母的单倍体和双倍体SILAC试验。
定量蛋白质组学中SILAC拥有最高定量精确度的美名，但是长期以来，蛋白质组学实验室一直缺乏优秀的软件和统一的标准对SILAC试验进行分析。Mann M实验室，作为SILAC方法的发明者之一，一直致力于完成整个方法学的最后一块基石-----分析软件。2008年前后，MAXQUANT的最初版本被提出来（Cox, J. and Mann, M. (2008) MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol 26, 1367-72. ），并很快被全世界众多的蛋白质组学实验室所采用。同年，首次MAXQUANT的大规模SILAC数据应用在国际著名科学杂志Nature上发表。
酵母作为最多被应用的模式生物，在蛋白质组学之前，基因组学已经用TAP和GFP方法对酵母的基因表达水平进行的大规模分析，在此文中，作者的大规模SILAC数据和原有的TAP和GFP数据大约有89%的重复性。其中，蛋白质学的方法独立地鉴定到了510个蛋白质分子，有数百个蛋白质分子在酵母的表达谱数据中显示只有低于50个copy，仅有6%的开放阅读框（ORF）没有被蛋白质组学方法鉴定而被基因组方法找到。这些都显示了蛋白质组学方法在数据深度上的优势。
图一 蛋白质组学数据（SILAC）和TAP、GFP数据之间的关系
此文中获得的蛋白质组学数据是非偏向性的，这一点可以从数据的结构和功能分布中看出来。其中，蛋白质组学数据中有很多低丰度的蛋白质分子的鉴定，而且膜蛋白质的鉴定比例高于基因组的比例（此文中鉴定到的酵母蛋白质分子中有30.9%为膜蛋白质，这个比例在基因组内是29.4%）。
图二 蛋白质组学数据和TAP、GFP数据在表达丰度上的比较
此文在方法学上尝试了多种组合。第一种是，酵母细胞在进行Lysine和Arginine双标记（SILAC）后，按照溶解性进行分级（5个组分），再将每个组分进行SDS-PAGE分级（每个组分分级成15份凝胶），最后对每个凝胶组分进行标准胶内酶解后上LTQ-orbitrap进行分析。第二种是，酵母细胞进行Lysine单标记后，直接进行溶解内酶解（Lys-C酶解），将酶解后的多肽产物进行IEF分级（24个组分），每个组分脱盐后分别进行LTQ-orbitrap分析。第三种方法是，将第二种方法的IEF分级产物（24个组分），在进行LTQ-orbitrap分析是根据母离子的分子量范围在m/z300-1800间分成5个段来进行扫描。从最后结果来看，酵母类的蛋白质组学，使用Lys-C来酶解蛋白质样品是比较不错的方案。总体上，此文的SILAC蛋白质组学方法总共鉴定了4399种酵母蛋白质分子（FDR<0.01），平均的蛋白质序列覆盖率达到32%。
图三 酵母SILAC蛋白质组学方法流程图
SILAC方法，作为一种重要的定量蛋白质组学方法，分析功能性的生物学样品是其主要用途。此文分析的是酵母的单倍体和双倍体样品之间的蛋白质组学区别，也就是和酵母这种模式生物的表观性现象有关给的分子水平差异。此文高精度的对蛋白质组学进行的定量分析，这一点可以从图四的散点图看出来，蛋白质分子的相对定量值，大部分都密集的分布于1左右，但是可以看到大量已知和酵母的性现象有关的分子处于统计学上有显著差异的区域。这些差异蛋白质分子被标记在蛋白质信号通路图上，更是显示了这些被定量蛋白质组学技术鉴定的分子和功能的密切联系。
图四 定量蛋白质组学（SILAC）数据分布图和酵母性现象之间的联系
蛋白质组学的发展几乎是紧跟着基因组，在每个重要的定量蛋白质组学工作中，都避免不了和基因组数据进行对比。此文中，SILAC得出的定量蛋白质组学数据，和转录组数据进行了大规模数据的统计学比对。如果从全部的定量数据进行对比，蛋白质组学和转录组学的数据在酵母上的相关性很低，暗示了蛋白质分子水平上的表达水平差别不能从转录组数据上进行合理的推测。但是如果把低信号值的转录组数据去除后，两者之间的数据相关性有较大改善，相关系数可以达到0.46。在研究和酵母新现象有关的蛋白质分子时，可以看到这些分子在转录组数据里也可以找到，但是蛋白质水平的差异和转录组数据间存在差异。总之，蛋白质作为功能的直接体现者，更理想的研究方法仍然是对蛋白质的定量数据进行直接分析。
图五 定量蛋白质组学数据和转录组数据之间的比较和相关性分析
编辑: helen
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