蛋白质二硫键定位技术应用报告
· 简介
二硫键广泛存在于原核和真核生物的激素、酶、免疫球蛋白、血浆、抑制剂和毒液等蛋白质中，是一种常见的蛋白质翻译后修饰。二硫键作为共价键交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，对稳定蛋白质的空问结构、维持正确的折叠构象、保持及调节其生物活性等都有着举足轻重的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置对于鉴定蛋白质一级结构有着重要的意义。分析多肽／蛋白质/抗体药物中二硫键的位置是SFDA对于药物申报的对于药物结构分析的建议检定项目。
早期确证二硫键配对方式，是通过HPLC肽谱比较还原性与非还原性酶解后的肽段混合物，找出并收集差异峰，通过氨基酸组成分析或N端测序来确定肽段序列，并推测二硫键的配对方式。该方法过程繁琐，精确度低，成功率低，很难确定复杂蛋白质样品的二硫键配对方式。
后来随着质谱的出现，应用MALDI-TOF分析还原性与非还原性酶解后的肽段混合物的质量肽谱图，确定二硫键相连肽段的分子量，从而推测二硫键配对方式。该法找到的肽段覆盖率较低，约为40%左右，只能找到少数的二硫键。另外，该法处于一级质谱水平，可信度大打折扣。
本中心应用更先进的液质联用质谱技术与多酶解相结合，提高了覆盖率到90%左右，从而显著提高了找到二硫键的机会。通过串联质谱技术，对找到的二硫键链接的肽段进行二级质谱分析，显著提高了结果的可信度。
· 基本思路：
(1) 将样品蛋白在避免二硫键重排或交换的条件下，尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段；
(2) 分离这些肽段混合物；
(3) 鉴定分离所得的各个肽段；
(4) 找到二硫键相连的肽段；
(5) 分析二硫键相连的肽段的碎片，确定二硫键链接的氨基酸位置，从而确定二硫键配对方式。
· 实验原理：
非还原状态下，用IAA将蛋白质游离的Cys封闭，再分别用trypsin、chymotrypsin或Glu-C进行酶切。酶解产物通过色谱分离和质谱检测后进行分析，通过匹配所得到的MS/MS图谱，找出二硫键连接的肽段，确定二硫键的配对方式。
· 实验流程：
编辑: helen
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