16种细胞损伤模型建立方法

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发布日期：2012-10-09 14:36 文章来源：丁香园
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关键词： 细胞 细胞培养 技术专题 义翘神州 丁香园 丁香通 　 点击次数：

十一、Ａβ损伤模型

取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死。在D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细胞记数，将细胞以 5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞维持在培养液中，置入5%CO2， 饱和湿度的培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次，培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/Ｌ,以抑制神 经胶质细胞的过度增殖,24ｈ后更换全部培养液继续培养,第10天进行细胞造模，开始实验。

也可以用PC12细胞株,常规培养

Ａβ产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：

选择Ａβ25-35片段,用三蒸水配制成100μmol??Ｌ-1,过滤,分装,-20℃冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。（将Ａβ25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀释，置于37℃下孵育7-14天，即为老化状态）。

细胞模型建立:加入浓度为20??mol/L的Ａβ25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型.

检测指标:MTT LDH 凋亡 细胞内钙离子 以及SOD等

十二、抑郁症的体外模型

抑郁等精神疾患的发生可能与过量GC对海马的选择性损伤有关,但机理不明,Heuser和Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营养因子表达水平降 低造成的,而抗抑郁剂不仅使GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常,而且使神经营养因子表达升高,达到治疗目的.PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞 株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征,其胞膜上GC受体表达丰富[6].本文根据文献方法以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑 郁及焦虑症神经细胞损伤状态

实验操作(MTT法测定细胞存活力)

嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调细胞 密度为2x108L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0.1g.L-1)处理过的96孔培养板,每孔10LL,放入CO2孵箱,培养3~4d,待细胞长满孔底 后即可用于实验.参照文献方法,稍加修改,吸去细胞液换上含有相应浓度药物及0.2mmol.L-1皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品),培养 48h,吸去培养液,用D2Hanks液洗2遍,每孔加入含0.5g#L-1MTT的无血清DMEM培养4h后吸去培养液,每孔加入10%十二烷基硫酸钠 100LL,待蓝色颗粒完全溶解(约12~16h),用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波长处的吸光度(A570nm)值,用于定量反映活细胞 数.

十三、125I-UdR致C6胶质瘤细胞损伤的模型

1、材料：125I-UdR购自中科院北京原子能所，放化纯度>95%。脱氧腺苷（AdR）、脱氧鸟苷（GdR）、脱氧胞苷（CdR）、脱氧尿苷（UdR）均为Sigma公司产品。

2、方法

（1）细胞培养：当癌细胞贴壁生长超过瓶壁的70%，用胰蛋白酶消化30-40s，传代培养。肿瘤细胞每3-4d传代1次。在50ml培养瓶中，细胞数达2×106个细胞后，取处于对数生长期的细胞进行细胞存活实验。

（2）细胞存活实验：将制备好的细胞按1×105个/ml细胞接种于25ml的培养瓶中，培养20小时，实验组加入125I-UdR74KBq/ml及不 同浓度的AUCG（10μM、20μM、30μM、50μM、80μM）再共同孵育24h后，100倍的倒置显微镜下观察细胞形态，收集细胞，制成单细胞 悬液，调整细胞密度，接种于25ml的培养瓶中，2-3d后换液，8-9d后细胞集落形成，每个剂量点设复瓶4瓶，同时设对照组未加AUCG，另设空白 组，均为4个复瓶。计算细胞存活分数，绘制细胞存活曲线。

3、检测方法

（1）采用TEM技术观察凋亡细胞超微结构：上述细胞用3%戊二醛固定后，PBS漂洗，1%锇酸固定1h，经包埋处理，超薄切片，在透射电镜（TEM）下观察细胞超微结构。

（2）琼脂糖凝胶电泳成像：收集加入125I-UdR74KBq/ml+AUCG30μM后培养24h的C6细胞2×105个，2500rpm离心 5min，去上清，加入裂解液，重悬细胞后，再加蛋白酶K消化30min，用等体积的平衡酚抽提两次，加入2倍体积的冰乙醇置-20℃2h，离心去上清， 以75%的冰乙醇洗涤两次后，加双蒸水溶解DNA，取8μl DNA溶液及上样缓冲液2μl上样稀释，用1.5%的琼脂糖凝胶，电泳40min，将凝胶板在紫外光下，观察照相。

（3）流式细胞分析

十四、内皮细胞损伤模型

1、细胞因子损伤模型

将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，加入细胞因子如IL－2，TNF－alpha、IFN等，共同孵育一段时间，或者加入药物与 之共孵育，或者加细胞因子之前先加入药物孵育后，再加细胞因子，结束后测一些指标如MTT、LDH、NO、等等看药物对细胞因子损伤的保护作用。也可采用 不同的时间、不同的浓度来观察。

2、缺氧－再供氧损伤模型

也是先将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，先将细胞置于95％N2和5％的CO2的混合气的缺氧槽环境中注意保持37度的温度， 用耗氧仪持续监测缺氧槽中的氧分压，使之保持在0.5 KP左右，细胞在低氧环境中培养一段时间后在移入正常的培养环境，可观察不同的缺氧时间、不同的给氧时间对内皮细胞形态功能的影响，也可结合药物观察，入 上所述。

此外，内皮细胞的损伤模型尚有双氧水损伤模型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、等等。最后提及一点，楼上说的ox-LDL损伤模型的浓度不是很 准确，因为从目前国内外的文献来看，oxLDL（10-50ug/ml）的浓度一般不会损伤内皮细胞尤其是内皮细胞系，如ECV304，恰恰相反，的浓度 的ox-LDL会促进细胞的增值，国内有人报道，ox-LDL造成ECV304凋亡的浓度一般为150ug/ml~200ug/ml,也有用100g /ml的。

十五、神经胶质细胞的制备和培养

1）取新生一周内大鼠，碘酒、酒精浸泡消毒后快速断头；

2）用眼科剪和镊剪除皮肤和颅骨，分离皮肤和颅骨时用不同的器具，弯剪剪取部分大脑皮层至60mm培养皿，培养皿内提前放置D-Hanks溶液；

3）解剖镜下取出脑膜及血管，转移组织至另一盛有D-Hanks溶液的器皿，将组织剪碎为1mm3左右的小块，然后小心转移至带螺帽的离心管内；

4）0.125%胰酶消化15-30分钟，以含10%胎（小）牛血清的DMEM培养基终止消化，巴氏吸管吹打，100目筛网机械过滤，制备混合细胞悬液；

5）计数，调整细胞密度，根据需求按适当密度种植于培养瓶或皿内；

6）放置于含5%CO2的37℃恒温培养箱，2-3天后换液，去除死亡及未贴壁细胞，以后每3-4日换液一次；

7）约两周后当细胞基本铺满时可在培养液中加用二丁酸环腺苷（dBcAMP，0.25mmol/L），该物质被认为有促进细胞分化和抑制小胶质细胞生长等作用；

8）根据细胞生长状况对培养细胞进行传代，多数文献建议用传代3-5次的星形胶质细胞进行实验，但一般不在换液或传代的当天；

少突胶质细胞和小胶质细胞的培养尚需在星形胶质细胞培养基础上进一步纯化，具体可参阅McCarthy和Giulian等的方法。

十六、2型糖尿病大鼠动物模型

1. 高脂＋STZ法：

ＳＤ大鼠购进后,适应环境2周。随机分为3组:正常对照组、高脂饮食组和高脂饮食+ＳＴＺ组,每组10只。

正常对照组:喂以普通饮食,其中碳水化合物60%,蛋白质22%,脂肪10%,其他8%。高脂饮食组及糖尿病组:喂以高脂饮食,其中碳水化合物40%,蛋 白质13%,脂肪40%,其他7%。糖尿病组高脂饮食喂养4个月后,一次性腹腔注射ＳＴＺ15ｍｇ (ｋｇ·ｂｗ),其他两组腹腔注射柠檬酸缓冲液,并继续高脂喂养。注射ＳＴＺ前及注射后10ｄ,分别测体重(ＢＷ)、空腹血糖(ＦＢＧ)、甘油三脂 (ＴＧ)、胆固醇(ＣＨ)、胰岛素(ＦＳＩ),注射前给予口服葡萄糖耐量及胰岛素释放试验:大鼠空腹10～12ｈ,尾静脉取血后(0ｈ),给予葡萄糖2ｇ (ｋｇ·ｂｗ)灌胃,然后0.5、1及2ｈ尾静脉取血,分别测血糖及胰岛素。

2. 脂肪乳＋四氧嘧啶法：

脂肪乳的制备　猪油占20 g ,甲基硫氧嘧啶1 g ,胆固醇5 g ,谷氨酸钠1 g ,蔗糖5 g ,果糖5 g ,吐温80 20 ml ,丙二醇30 ml ,加水定容至100 ml , 配成脂肪乳。

将灌胃脂肪乳10 d 的Wistar 大鼠,腹腔注射四氧嘧啶（两次给药法成模率较高,第一次腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg - 1 ,第二次腹腔注射四氧嘧啶100 mg·kg - 1） 。注射容积为0.2 ml·kg - 1 。

编辑: gaowei2010

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