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贴壁细胞消化传代的简单方法

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发布日期：2012-10-09 15:09 文章来源：丁香园
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关键词： 细胞 细胞培养 技术专题 义翘神州 丁香园 丁香通 　 点击次数：


贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：

一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；

二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。

但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。

一种简单的消化传代方法：加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。

对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。

对付难消化细胞的另一种方法：弃取培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有细胞脱落。

注：EDTA对细胞肯定有伤害，EDTA可以与细胞膜上很多大分子蛋白上的中金属成分发生螯合，致使蛋白变性影响蛋白质的生物活性而发生损伤。但是，这种损伤是可逆的。就细胞传代所用的浓度和时间条件下，还不致对细胞产生过大影响。其实Hyclone的胰酶中就有EDTA。因此在一般细胞操作中不能用TE代替PBS洗细胞。

消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。

消化时间不应超过5分钟，否则对细胞损害很大。消化液覆盖细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷细胞，当细胞收缩，部分细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上细胞。应该没问题。
 

编辑: gaowei2010

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