常用细胞凋亡检测方法（图）

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发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

四、配试剂：

1、DMEM不完全培养基：DMEM；Hepes 3.08g；NaHCO₃ 3.7g；100U/ml青霉素/100mg/L链霉素。（调PH至7.2-7.4），不加血清为不完全培养基。

2、100U/ml青霉素/100mg/L链霉素：
     青霉素80万U+NS→40ml
     链霉素100mg/L+NS→50ml取40ml
     混成80ml，抽滤分装，4℃保存。

3、DMEM完全培养液
     DMEM
     10%胎牛血清（已灭活）
     5%马血清
     调pH7.2-7.4
     加100U/ml青霉素、100mg/L链霉素约1ml

4、RPMI1640不完全培养液：
     RPMI1640，25mM HEPES，用5%NaHCO3调节pH至7.4，灭菌后4℃保存，即：
      RPMI-1640 10.4g
     Hepes 3.58g
     三蒸水 1000ml
      1N NaHCO₃（或NaOH）调pH值至7.2-7.4抽滤分装90ml/瓶，4℃或-20℃冻存。

5、RPMI1640完全培养液：
     25mM HEPES，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，100U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素及20%FCS，用5%NaHCO₃调节pH至7.4，灭菌后4℃保存。
     RPMI-1640不完全培养液，加100U/ml青霉素/100mg/ml链霉素，临用前加入10%或20%FCS（v/v，胎牛血清），用1N NaHCO3调节pH值7.4，抽滤灭菌后4℃保存。

6、0.25%胰蛋白酶（DMEM配）
     胰蛋白酶250mg
     DMEM 100ml
     抽滤分装小青瓶，-20℃冻存

7、0.25%胰蛋白酶（RPMI 1640配）
     胰酶250mg，加RPMI 1640 100ml，用0.1N NaHCO₃调节pH至7.4，灭菌后4℃保存。

8、 Hank’s平衡盐溶液：5.4mM KCl, 0.3mM Na₂HPO₄, 0.4mM KH₂PO₄, 4.2mM NaHCO₃, 1.3mM CaCl₂, 0.5mM mgCl₂, 0.6mM MgSO₄, 137mM NaCl, 5.6 mM D-葡萄糖，0.02%(w/v)酚红。

9、0.1M pH7.4 PBS:
     137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄•7H2O, 1.4mM KH₂PO₄。

10、1%多聚甲醛：多聚甲醛1g，加0.01M pH7.4 PBS至100ml。

11、抗体稀释缓冲液：0.01M PBS, 0.1%BSA, 0.1Na₃N。

12、小牛血清：
     56℃，灭活30分钟
     分装小青瓶，10ml或20ml/瓶

13、马血清：
     56℃，灭活30分钟
     分装小青瓶，10ml或20ml/瓶

14、0.1M PBS:
     137mM NaCl
     2.7mM KCl
     4.3mM Na₂HPO₄•7H₂O
     1.4mM KH₂PO₄

15、7.4%NaHCO₃
     NaHCO₃ 7.4g
     双蒸水 100ml
     抽滤分装小青瓶，4℃保存。

16、0.1N HCl
     1N HCl 10ml
     双蒸水 100ml
     抽滤分装小青瓶，4℃保存。

17、多聚赖氨酸（包被用）：
     多聚赖氨酸氢溴化物溶解于150m mol/L硼酸钠缓冲液中，（pH8.4），终浓度为1mg/ml，抽滤灭菌。（玻璃器皿可用50μg/ml多聚-L赖氨酸氢溴化物的水溶液。）

18、神经生长因子：
     用pH5.0的醋酸钠缓冲液（0.1mol/L）配置NGF（2.5S）250μg/ml贮存液，使用前再用培养液稀释，贮存液的浓度太低，活性容易丧失，贮存液应冻存于-80℃，一旦冻融后不宜再冻存，所以应将其分装成小份冻存，冻融后的NGF贮存液可分装于EP管中，置于4℃贮存，其活性可保存数月。

五、操作步骤：

1、将多聚-L-赖氨酸氢溴化物（终浓度1mg/ml），经过滤除菌后用于包被培养皿，在室温作用4小时后，吸去包被溶液，并将培养皿用无菌培养用水漂洗4次，置超净台里晾干。（可再予紫外线照射20分钟灭菌）。（对玻璃器皿，可将经过滤除菌的多聚-L-赖氨酸氢溴化物水溶液50μg/ml加于玻璃器皿表面包被1小时，然后用无菌培养用水漂洗4次，并置超净台内空气干燥。

2、将PC12细胞（2×104或2×105）接种于含10%胎牛血清、5%马血清， 100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM完全培养液（pH7.2）的塑料培养瓶（或培养皿）中。

3、置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

4、细胞接种后，每2-3天换液一次。每次更换约2/3的培养液，并在倒置显微镜下观察PC12细胞是否贴壁。

5、80-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，D-Hank’s液收集细胞，调整细胞数。转种到6孔培养板中（可以先用多聚赖氨酸包被）。接种密度为5×10⁵/ml.孵育48h后作为实验细胞。（有人每周按1：4传代）。如准备用于激光共聚焦显微镜照相，可先将处理过的24mm×24mm盖玻片，再转种细胞到6孔培养板中。

6、吸去培养液，用D-Hanks液洗2遍，每孔加入含干预药物的无血清DMEM不完全培养液适当时间，可以进行测定增殖、凋亡或细胞周期情况。

7、简述：（南医大神经药理）将PC12细胞接种于培养液中，培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2条件下培养，待细胞长满瓶底后，倾去培养液，用D-Hank’s液轻轻荡洗两次，用吸管轻轻吹打数次，使细胞完全分散，倒置显微镜下观察计数，调整细胞浓度为：5×105个/ml，接种于24孔培养板，待细胞长成连续单层后，予干预。

8、神经生长因子诱导PC12细胞分化神经纤维：要求：（1）细胞密度: 2.5-10×10⁴ cell/cm²（2）塑料培养皿的包被。上述细胞培养24小时后，换入含2.5S NGF(50ng/ml)的DMEM完全培养液，以后隔天换液（含NGF）；取NGF分化5-10天后的PC12细胞用于实验。（一般情况下，NGF诱导10-14天时，NGF可使PC12细胞长出神经纤维，并形成致密的网络）。

9、PC12细胞凋亡模型的制备与干预：（1）无血清诱导：PC12细胞培养后用无血清的DMEM洗三次，加无血清的DMEM培养12小时，然后予各种干预。最后予4℃预冷的75%乙醇固定后，送流式细胞仪以PI（碘化丙啶）检测。（2）谷氨酸诱导：配置含80μM-10mM终浓度的谷氨酸（经典用10mM）的DMEM不完全培养液（不含血清），处理24小时（6-24小时，可偏长一点）后，再予各种干预，最后送流式细胞仪测定细胞凋亡（有人要求在无血清培养基中先培养8-24小时后，再加含10mM谷氨酸的不完全DMEM培养液培养6-24小时。）（3）缺氧诱导：首先设置低氧环境，将培养箱内充入95%氮气代替空气，同时充入5%二氧化碳，条件稳定后（5%二氧化碳：5%氧气），将细胞置入培养，分别培养30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时，取出细胞，将细胞吹打成细胞悬液，1000r/min离心30分钟，倾去上清，PBS洗涤一次，离心去上清后，迅速注入3ml 4℃70%的冷乙醇，边注入边振摇，同时反复通过7号针头的注射器抽打5次（或用振匀器振匀），以避免细胞成团，送流式细胞仪PI检测。

10、吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（细胞爬片），在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存。）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。（如制成细胞悬液，取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。）（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。）

编辑: cq

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