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真核重组让研究更有价值

● 真核细胞本身的蛋白，尽量用真核表达，真核的表达环境使蛋白更有可能形成正确的结构，具备糖基化等修饰，更可能具有天然功能。而目前生命科学研究中，研究的模式生物大都为真核生物。


● 在真核细胞表达真核细胞的蛋白，折叠、修饰等方面更接近于天然蛋白，一般内毒素更低。这样试验过程才更接近真实的细胞活动。


● 如果你的运气足够好，发现你的实验结果可以为药物开发提供线索。恭喜你！如果你的实验是用真核表达的重组蛋白完成的，药企肯定会更感兴趣，因为这样的药物候选分子商业化风险更小。

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细胞培养常见问题及回答

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发布日期：2012-02-16 14:47 文章来源：丁香园
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

1、如何选用培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：

细胞系   细胞类型   种   组织   推荐使用的培养基  
293   成纤维细胞   人   胚胎肾   MEM，10% 热灭活马血清  
3T6   成纤维细胞   小鼠   胚胎   DMEM, 10% 胎牛血清  
A549   上皮细胞   人 肺癌    F-12K, 10%胎牛血清  
A9   成纤维细胞   小鼠     结缔组织 DMEM, 10% 胎牛血清    
AtT-20   上皮细胞   小鼠       垂体肿瘤   F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清  
BALB/3T3   成纤维细胞   小鼠       胚胎   DMEM, 10% 胎牛血清      
BHK-21   成纤维细胞     仓鼠   肾   GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA  
BHL-100   上皮细胞     人   乳房   McCoy'5A, 10% 胎牛血清  
BT   成纤维细胞   牛   鼻甲骨细胞   MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2   上皮细胞       人   结肠腺癌   MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA  
Chang   上皮细胞       人     肝脏   BME, 10% 小牛血清  
CHO-K1   上皮细胞       仓鼠   卵巢   F-12, 10% 胎牛血清  
Clone 9   上皮细胞       大鼠   肝脏     F-12K, 10% 胎牛血清  
Clone M-3    上皮细胞       小鼠   黑素瘤   F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清  
COS-1   成纤维细胞 猴   肾   DMEM, 10% 胎牛血清  
COS-3  成纤维细胞   猴   肾   DMEM, 10% 胎牛血清  
COS-7   成纤维细胞   猴   肾   DMEM, 10% 胎牛血清  
CRFK    上皮细胞   猫   肾   MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA  
CV-1   成纤维细胞 猴   肾     MEM, 10% 胎牛血清  
D-17   上皮细胞     狗   骨肉瘤   MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA  
Daudi   成淋巴细胞   人   淋巴瘤病人血液   RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮细胞 大鼠   垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清  
GH3 上皮细胞   大鼠   垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清  
H9   成淋巴细胞   人   T细胞淋巴瘤   RPMI-1640, 20% 胎牛血清  
HaK   上皮细胞   仓鼠   肾   BME, 10% 小牛血清  
HCT-15  上皮细胞   人   结肠直肠腺癌   RPMI-1640, 10% 胎牛血清  
HeLa   上皮细胞   人   子宫颈癌   MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)  
HEp-2   上皮细胞   人   喉 癌   MEM, 10% 胎牛血清  
HL-60   成淋巴细胞   人   早幼粒细胞白血病   RPMI-1640, 20% 胎牛血清  
HT-1080   上皮细胞   人     纤维肉瘤   MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA  
HT-29   上皮细胞   人     结肠腺癌   McCoy's 5A, 10% 胎牛血清  
HUVEC    内皮细胞    人    脐带   F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml  
I-10   上皮细胞   小鼠   睾丸癌    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清  
 IM-9    成淋巴细胞   人 骨髓瘤病人骨髓    RPMI-1640, 10% 胎牛血清  
 JEG-2    上皮细胞   人    绒毛膜癌    MEM, 10% 胎牛血清  
 Jensen    成纤维细胞  大鼠    肉瘤    McCoy's 5A, 5% 胎牛血清  
 Jurkat    成淋巴细胞    人    淋巴瘤     RPMI-1640, 10% 胎牛血清
 K-562    成淋巴细胞    人    骨髓性的白血病     RPMI-1640, 10% 胎牛血清  
 KB    上皮细胞  人    口腔癌    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA  
 KG-1    骨髓白细胞    人    红白血病病人骨髓    IMDM, 20% 胎牛血清  
 L2    上皮细胞    大鼠      肺    F-12K, 10%胎牛血清  
 L6      大鼠    骨骼肌成肌细胞    DMEM, 10% 胎牛血清  
 LLC-WRC 256    上皮细胞      大鼠    癌    Medium 199, 5% 马血清  
 McCoy    成纤维细胞    小鼠    未知    MEM, 10% 胎牛血清  
 MCF7    上皮细胞    人    乳腺癌    MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素  
 WEHI-3b    类巨噬细胞    小鼠      骨髓单核细胞白血病   DMEM, 10% 胎牛血清
 WI-38    上皮细胞    人   胚胎肺      BME, 10% 胎牛血清  
 WISH    上皮细胞    人    羊膜    BME, 10% 胎牛血清  
 WS1      人    胚胎皮肤      MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
 XC     上皮细胞    大鼠   肉瘤       MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA  
 Y-1    上皮细胞    小鼠    肾上腺瘤    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清  

2、为什么要热灭活血清？

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

3、L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

4、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。

5、为什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6、如何用台盼兰计数活细胞？

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7、如何消除组织培养的污染？

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

① 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

② 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

③ 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

④ 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。

⑤ 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

⑥ 重复步骤4。

⑦ 在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。

8、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？

GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

10、目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？

Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2 培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

编辑: cq

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