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发布日期：2012-02-17 11:48 文章来源：丁香园
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

十二、胸腹水细胞染色体制备

在恶性肿瘤的胸腹水中有大量的分裂期细胞，其中多以非整倍体细胞存在，并含有各种标记染色体。

1、 实验材料

2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉球、镊子20-22号、无菌腰穿包、50ml离心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片等。

2、 操作过程

（1）采样：选择有胸或腹水患者，在无菌条件下，轻腹穿刺或于手术取胸或腹水20-50ml；

（2）培养：立即加入秋水仙素培养，最终浓度为0.02-0.04ug/ml胸腹水，置37℃培养箱内4-6小时；

（3）低渗及后期制作羊水细胞。

十三、染色体制备体会

1、 培养基PH浓度、小牛血清量及培养箱温度的恒定是培养成功关键；

2、秋水仙素适量、适宜的处理时机和时间，是获得良好、足够分裂相的条件。分裂相的多少和染色体形态及带型处理良好与否均受其影响。

3、低渗处理是获得分散良好的分裂相关键步骤，低渗过度或不足都会造成染色体形态不良的结果。在低渗处理时期细胞十分娇嫩，并且表面发粘，低渗细胞混匀时，吹打要适宜，避免细胞破碎及粘团，另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部，避免细胞丢失。

4、固定技术是制备良好分散的染色体的重要步骤。若染色体分数不良，可适当加大冰乙酸含量，其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷，但过量会造成染色体形态变化和影响分带结局。染色体形态不良与固定液速度有关，加第1次固定液过快或打过快，可造成飘带样染色体；

 5、固定液每次使用必须新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定效果。

6、滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步。首先要载玻片要非常干净，否则会影响染色体的分散和分带效果。其次是滴片的距离、滴加量多少、制片的方式都会影响染色体分期效果。

 7、烤片：是染色体制备中最后一步技术。烤片的温度、时间与染色体形态和分带有关。不宜温度过高和烤片时间过长。

十四、染色体实验技术分析

染色体分裂指数低：患者处于非常时期（感染期、放、化疗期）；培养基营养成份不良；培养基PH偏低或偏高；PHA过量或不足；小牛血清质量不高；小牛血清数量偏低或过高；培养温度不稳定；培养箱温度偏低；秋水仙素处理时间过短；离心时间或速度不足；制备过程损失过大。

染色体形态不理想：受检者处于非常时期；PHA过量；小牛血清质量不高；培养箱温度不恒温；秋水仙素量不当；低渗时间不理想；低渗温度过高；离心速度过高；固定液加速过快；固定混匀手法过重；吹片技术不良。

染色体形态偏长：培养基PH偏酸；秋水仙素量偏低；秋水仙素处理时间偏短；

染色体形态偏短：培养基PH偏碱；秋水仙纱处理量过量；秋水仙素处理时间过长。

染色体分带不良：血液状况不良；培养基营养成分不良；小牛血清质量不高；小牛血清数量不当；培养箱培养温度不良；秋水仙素处理量过高；PHA量过高；低渗处理时间或温度不良；胰酶质量不良；染色液质量不良；染色技术不良；分带技术不佳。

染色背景不良：培养细胞生长不良；低渗处理技术不良；离心过程尘染；分带技术不良；染色技术不良；染色液尘染；载玻片处理不干净；制片过程尘染；存片环境不干净。

培养失败：培养中损失；血源质量不良；培养中感染；小牛血清污染；培养箱温度失控；PHA过期或过量；秋水仙素失效；低渗失败； 离心机失误。

标本损失：培养中损失；制备中损失；分带中损失；保存中损失。

十五、染色体分带技术

染色体显带技术是在显示染色体基础上发展起来的技术，其优点是能显现染色体本身更细微的结构，有助于更准确地识别每条染色体及染色体异常疾病。染色体分带技术能适用于各种细胞染色体标本。

染色体显带是沿着整条染色体的长轴，能显现出着色深浅不同、横向走的带型。目前认为染色体显带现象是染色体结构所致。但用特殊方法处理后，再用染料染色，则带型更加清晰，随显带方法不同，显现出的带型的特点也不一样，这说明带的出现与染料的特异结合相关。人类染色体能显现出近2000个G带，这些带再融合成一般显微镜下可见的850条左右的高分辩染色体带型或350条带左右的常规带型。

常见的几种显带方法：

（一）G带

也称为G显带，是最常用的显带方法，具有操作简便、经济及标本能长期保存等优点。

1、Giemsa原液的配制：

（1）称3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少许丙三醇研磨，研磨越细越好；

（2）将研细的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶内，丙三醇的总量为250ml，用一定量甲醇洗干净研磨器。

（3）摇匀，置60℃水浴锅24小时或37℃温箱72小时，经常摇动。

（4）取出冷却后，加甲醇总量至250ml混匀，密封棕色瓶备用。贮藏时间越长，染色效果越好。

2、实验材料：

中期染色体标本；0.9%氯化钠注射水；3%tris液体；0.25%胰蛋白酶；Gremsa染色液；蒸馏水；水浴锅；立式染缸；定时器或时针；温度计；镊子及纱布；刻字笔。

3、操作程序：

（1）消化液配制：取0.9%氯化钠注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶盐水消化液，加4-5滴tris液调PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴锅中备用；

（2）染液配制：取立式染缸，加蒸馏水500ml，加3滴tris液调PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管调匀备用；

（3）漂洗液：取立式染缸一个，内加蒸馏水备用；

（4）试消化：待消化液温度在37℃左右时，取同批标本较多者标本1张，分二节或三节进行消化，每节相差十五秒左右，从45秒或60秒开始增减。取出后先在纱布或吸水纸上直立除去带出胰蛋白酶，后置蒸馏水染缸内漂洗，取出后，标本斜面朝上，刮去染色缸内染液上浮膜，沿槽插入，每分钟移动1次，染色3-5分钟。

（5）洗片：从染色缸中取出标本玻片，自来水冲洗，取刻编号面朝上用纱布干净玻片背部染色，稍干，高倍镜下观片，确定分带与染色时间。

（6）分带：取4张待分带标本玻片，细胞面朝左侧按顺序插入37℃的消化液中，消化时间较试消化选择时间延长5-10秒钟，取出每片间隔时间约10秒钟左右。

（7）消化及染色调整：每次消化完一批标本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化时间不变。同样，每次染色一批标本后加Giemsa染色液2-3滴，调匀，每次染色时间不变；

（8）Giemsa染色调整：若Giemsa染色标本偏红，说明染色液偏酸，可加tris数滴调蓝，若Gremsa染色标本偏蓝则说明tris加多了；

（9）保存：将分好带的及观察中的标本及时收集于玻片盒内保存，防止细胞涂面灰尘污染及擦损。

注意：Giemsa消化染色过程中，有两个重要的环节，一是胰酶消化环节，消化不足带不出现，消化过度染色体变得膨胀和不着色，必须把握好胰酶浓度、消化时间和消化温度；二是预处理或老化环节，对消化和带型清晰度有很大影响，其中80℃2小时热处理，是简便易行和效果较好的办法。

（二）姐妹染色单体分化染色

姐妹染色单体差别染色可使中期染色体显示深浅不同的两条单体，能借以观察姐妹染色单体互换（SCE）现象。SCE是两条染色单体在DNA合成中核苷酸序列发生互换而表现出来一种现象。即是细胞分裂是DNA同源重组的结果。SCE既是一种无害的变化（有生理波动），也可受射线、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映细胞的损伤与修复状态。

1、原理：

在细胞培养过程中，加入一定是的5-溴脱氧尿苷（BudR ）,当细胞在DNA复制过程时，BudR能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合DNA中。因此，当细胞处于第二个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BudR的DNA链构成，而另一条为单股含有BudR的DNA链。在结构上双股含BudR的DNA螺旋化程度较低，故对染色剂亲合力低，在用Giemsa染色时其单体着色浅，只有单股含BudR的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。

2、BudR贮存液的配制：

BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解），然后加蒸馏水至 5ml，即成1000ug/ml的贮存液，因BudR遇光会发生分解，贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。

3、实验材料：

所检培养细胞；BudR贮存液；2×SSC液；常规染色体制片所需物品；水浴锅；20W紫外灯一个；培养皿；镜头纸。

4、操作程序

（1）BudR掺入：细胞培养24小时后于培养液中加入BudR，最终浓度5-15mg/ml，避光条件下继续培养。

（2）终止培养：待细胞经历两个细胞周期（48小时），培养终止前3小时加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02ug/ml培养液；

（3）常规制片及烤片；

（4）紫外灯照射：取标本玻片置于大号培养皿内，正面朝上，上覆盖镜头纸，从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿，移入50-60℃水浴锅内，紫外线灯距离5cm，照射30-40分钟；

（5）染色：取出照射后标本，蒸馏水冲洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分钟；

（6）洗片及存片：同G带片。

注意：BudR是一种强突变剂，使用浓度不宜过高，否则会产生细胞毒性作用。

（三）染色体脆性部位（fra）

脆性位点也称危性部位，是在一定的培养条件下人类染色体上某些特异位点非随机地表现出的裂隙和断裂。脆性部位分为普通型和罕见型两大类。

1、实验材料

（1）常规外周血所用物品。

（2）培养基是用不含叶酸的MEM-Fra培养基或低叶酸的CT199培养基。

2、培养液配制

MEM-Fra 90-95%

小牛血清 5-10%

双抗 100u/ml

PH调至7.5左右

3、操作程序

与制备外周血的染色体方法相同。

注：脆性X综合症：（FraX）

这种染色体改变是在1969年被发现，1977年被定位于Xq27、记录为fra（X）（q），并命名为脆性部位。X连锁智力低下（MR）与fra（X）（q27）密切相关。FraX的发生率占新生儿的1/2500；占X连锁MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其发生率仅次于先天愚型。

编辑: cq

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