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真核重组让研究更有价值

● 真核细胞本身的蛋白，尽量用真核表达，真核的表达环境使蛋白更有可能形成正确的结构，具备糖基化等修饰，更可能具有天然功能。而目前生命科学研究中，研究的模式生物大都为真核生物。


● 在真核细胞表达真核细胞的蛋白，折叠、修饰等方面更接近于天然蛋白，一般内毒素更低。这样试验过程才更接近真实的细胞活动。


● 如果你的运气足够好，发现你的实验结果可以为药物开发提供线索。恭喜你！如果你的实验是用真核表达的重组蛋白完成的，药企肯定会更感兴趣，因为这样的药物候选分子商业化风险更小。

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培养细胞的冷冻保存与复苏

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发布日期：2012-02-17 12:15 文章来源：丁香园
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 培养基 　 点击次数：

冻存细胞的复苏

非玻璃化冻存的复苏方法  

主要材料

（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；

（2）培养用液：完全培养液。

复苏过程

（1）调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；

（2）从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃ 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；

（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；

（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；

（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

结果

复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

玻璃化冻存的复苏方法

以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。

主要材料

（1）设备：高速离心机；

（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。

操作过程

（1）将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；

（2）将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；

（3）沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；

（4）将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。

结果

复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。

编辑: cq

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