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真核重组让研究更有价值

● 真核细胞本身的蛋白，尽量用真核表达，真核的表达环境使蛋白更有可能形成正确的结构，具备糖基化等修饰，更可能具有天然功能。而目前生命科学研究中，研究的模式生物大都为真核生物。


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细胞培养基的使用方法（微孔滤膜过滤除菌）（图）

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发布日期：2012-02-17 14:22 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 培养基 　 点击次数：

图3 199（MD502）在相同pH值所加的碳酸氢钠、氢氧化钠的量及所对应的培养液渗透压

4、灭菌方法

培养基的灭菌方法主要有两种，高压除菌及0.22um微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比，高压灭菌的工作强度小，成本较低，但易造成营养成分的流失，而且在多次加样（无菌谷氨酰胺溶液，无菌碳酸氢钠溶液等）过程中容易造成二次污染。大多数培养基采用0.1～0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌，并且已成为培养基除菌的发展方向，它可低限度地减少培养基的营养损失。

4.1 高压灭菌
 
某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，例如清大天一的MEM培养基中的MD605、MD609等。这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的无菌的液体。另外可高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。

可高压灭菌的培养基在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证很关键。

4.2 过滤灭菌

可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。一般情况下采取正压过滤，正压过滤较之负压过滤具有流速高、过滤快、不易污染，可避免蛋白质产生大量气泡等优点。一般使用过滤器可参照各供应商的产品说明书。

目前大多数实验室和制药企业采用微孔滤膜滤器（如Zeiss滤器）或立式微孔滤器（Millipore、Pall）除菌。微孔滤膜滤器为不锈钢，中间可夹放0.22um滤膜。使用这种滤器最重要步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。如在使用Zeiss滤器时，先要用培养用水将滤膜充分润湿，在安装滤膜时可在其上放置一层定性滤纸再固定。消毒时旋钮不要扭太紧，凡与空气接触部位都要包好（可用牛皮纸、纱布、无纺布等）；高压灭菌后，在无菌环境中立即将旋钮扭紧。过滤除菌结束后，要打开滤器，检查滤膜是否完整，如果滤膜破裂，需重新进行过滤除菌过程。立式微孔滤器可以选用不同的微孔滤柱体积，因为滤膜的折叠，膜面积显著增大，液体处理量大，而且不容易发生堵塞现象。
 
5、细胞培养液的储存

细胞培养液的储存条件一般为2～8℃、密闭、避光保存，但要注意如下几点：

(1) 过滤后的完全培养液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用，一般在2～3周内使用完。

(2) 灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液，一般可在4℃保存6～9个月，也可冷冻保存,用时解冻。

(3) 高压除菌后的培养基应置4℃保存，不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。

(4) 添加了谷氨酰胺的培养液放置2周后，要补加和原来同样量的谷氨酰胺，但这样并不能消除谷氨酰胺降解产生的游离氨，建议配制好的培养液尽快使用。

图4 pH为7.6时不同温度2mM谷氨酰胺的稳定性

图 5 室温下不同pH时10mM谷氨酰胺的稳定性

(5) 添加某些生长因子、激素等添加物，可能会改变培养液的储存条件，比如温度、时间等方面的要求。

细胞培养基从1903年开始发展到现在，有199、MEM、DMEM、RPMI1640等基础细胞培养基，还有低血清细胞培养基、无血清细胞培养基甚至无蛋白培养基，种类繁多、各具特点。在使用过程中，只有根据各类细胞培养基的特性、特点正确的选择配制方法、灭菌方法、储存方法，才能最大程度地保持细胞培养基的营养，发挥细胞培养基的功效。

编辑: cq

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