神经细胞培养

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发布日期：2012-02-17 14:39 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 神经细胞 　 点击次数：

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧海马，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后，用种植培养液(同第二节)稀释成5×10⁵个细胞/ml密度的细胞液，接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中，每皿2ml，置标本于36℃,含10%CO₂ 的培养箱内培养。24 h后顷去培养皿内种植培养液，改用饲养培养液(同第二节)培养。接种第5 d，在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5'-氟- 2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神经细胞的过度增殖，作用48h 后更换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换50%新鲜培养液。

2、新生大鼠海马神经元的生长分化和形态特征

新生大鼠海马神经元种植后12h，部分细胞可贴壁，呈圆形，其中少数神经细胞开始伸出1-2个突起。培养24h后，伸出突起的神经细胞逐渐增多，突起一般为20-40μm，长者可达60μm。培养3d后, 神经元突起进一步增多并延长，形成稀疏的网络。培养的海马细胞以锥体细胞为多见，胞体较大，直径6-12μm。随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐增大，胞突主干和分技明显延长并增粗，形成更加稠密的网络。海马神经元在体外可维持培养2个月。

六、新生大鼠隔神经元分散培养

隔亦属大脑边缘系统，主要与一系例内脏活动、躯体活动，情绪活动有密切关系。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧隔区，培养方法同海马神经元培养。

2、新生大鼠隔神经元的生长分化和形态特征

新生大鼠隔区培养神经元的生长分化基本上与新生大鼠海马神经元相似。但隔神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形, 直径6-8μm。随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,神经突起逐渐增粗, 并互相联络成网。新生大鼠隔神经元亦可持续培养2个月。

七、新生大鼠下丘脑神经元分散培养

下丘脑，作为神经系统和内分泌系统的连接点，在神经内分泌研究中有很重要的地位。它不仅通过神经-神经，神经—体液通路与垂体发生直接的联系，以兴奋与抑制两种不同的机制维持垂体内分泌的相对恒定，而且与脑干网状结构、皮质边缘系统等共同调节机体的各种活动。下丘脑的分泌功能以及其所分泌的各种肽类激素、神经多肽是下丘脑参与调节内脏活动、生理机能以及垂体内分泌的重要物质基础。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧下丘脑，培养方法同海马神经元培养。

2、新生大鼠下丘脑神经元的生长分化和形态特征

新生大鼠下丘脑神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠隔神经元相似。培养的下丘脑神经元大多为具有两个突起的双极神经元，神经元胞体呈椭圆形，直径6-8μm，偶见胞体较大(直径9-12μm)的多极神经细胞。随着培养时间的延长，下丘脑神经元胞体逐渐增大。下丘脑神经元亦可维持培养2个月。

八、新生大鼠大脑皮层神经元分散培养

大脑皮质是大脑半球最外表的一层灰质，大脑皮质内神经元的数量极大，其类型也很多，但均属多极神经元，神经元之间具有复杂的联系，反映皮质的高度发展。有人从机能上将皮质分为：感觉皮质、联络皮质、运动皮质。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧皮层，培养方法同海马神经元培养。

2、新生大鼠大脑皮层神经元的生长分化和形态特征

新生大鼠皮层元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠海马神经元相似。培养的皮层神经元中既可见到体积较大(直径8-12μm)的锥体细胞和颗粒细胞(如星状细胞、篮状细胞和梭形细胞)，也可见到马提诺蒂细胞，胞体较小，呈三角形或多角形。随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐增大，突起增粗。新生大鼠皮层神经元亦可持续培养2个月。

九、新生大鼠纹状体神经元培养

位于大脑皮质下，紧靠丘脑背外侧的几块灰质，称为基底神经节，它们包括尾状核、壳核和苍白球，前两者合起来又称为纹状体。纹状体是中枢神经系统的高级部位，在这里进行着运动机能的最高级整合，它们与随意运动的稳定、肌紧张和躯体运动的整合有密切关系。中脑黑质除含有较多的多巴胺（DA）神经元外，还含有γ-氨基丁酸（GABA）神经元等，纹状体是其主要的靶组织，共同组成黑质纹状体DA系统。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧纹状体，培养方法同海马神经元培养。

2、新生大鼠纹状体神经元的生长分化和形态特征

新生大鼠纹状体神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠隔神经元相似。培养的纹状体神经元大多为具有两个突起的双极神经元，神经元胞体呈椭圆形，直径6-8μm。随着培养时间的延长，纹状体神经元胞体逐渐增大。纹状体神经元亦可维持培养2个月。

十、新生大鼠中脑黑质神经元培养

黑质由中脑背侧的致密部和腹侧的网状部组成，中脑黑质是多巴胺神经元存在的部位，实验表明，大鼠中脑腹侧多巴胺在运动和行为中起着关键性的作用。黑质多巴胺能神经元退性病变可引起帕金森综合症。因此，多巴胺神经元的体外培养为多巴胺神经元的形态、受体分布、药物作用、电生理特性的研究以及多巴胺神经元移植研究提供了较好的实验手段。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧黑质，培养方法同海马神经元培养。

2、新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征

新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠下丘脑神经元相似。培养的中脑黑质神经元大多为具有两个突起的双极神经元，神经元胞体呈椭圆形，直径6-8μm，随着培养时间的延长，中脑黑质神经元胞体逐渐增大。中脑黑质神经元亦可维持培养2个月。

十一、新生大鼠小脑神经神经元培养

小脑由外层的灰质（皮质）、内部的白质和三对深部的核团（顶核、间位核和齿状核）组成。与大脑皮质相比，小脑皮质的结构和神经元环路的组成相对简单，整个小脑皮质共有三层结构：分子层、浦肯野细胞层和颗粒层。其中含有五种神经元，即颗粒细胞，浦肯野细胞、篮状细胞、星形细胞和高尔基细胞。小脑是中枢神经系统中最大的运动机构，主要作用是维持躯体平衡，调节肌肉张力和协调随意运动。小脑的另一个与运动有关的重要功能是在技巧性运动的获得和建立过程中发挥运动学习的作用。在体外培养系统中，小脑细胞大小和形态的特征明显，容易识别。另外，小脑缺陷神经突变的小鼠种系比较多，这些条件都使小脑细胞成为发育研究的良好对象。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧小脑，培养方法同海马神经元培养。

2、新生大鼠小脑神经细胞的生长分化和形态特征

新生大鼠小脑神经元的生长分化基本和新生大鼠皮层神经元相似。培养的小脑神经元以颗粒细胞为多见，体积较小，直径3-5μm，亦可见到一定数量的星状细胞，哺肯野细胞和篮状细胞(胞体直径6-8μm)，它们均随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐增大，突起逐渐增粗。新生大鼠小脑神经元亦可持续培养2个月。

十二、新生大鼠脑腺垂体细胞培养

大鼠的垂体分为前、中、后三叶，前叶亦称腺垂体，主要分泌生长激素、催乳素、各种促激素及黑素细胞刺激素。因此建立体外培养腺垂体细胞的方法，可用来探讨各种因素直接对细胞分泌功能的影响，以及开展神经内分泌分子生物学的研究。

1、材料和方法

取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下分离出腺垂体，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成2×10⁶个细胞/ml密度的细胞液，接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中，每皿2ml，置标本于36℃，含10%CO₂ 的培养箱内培养。24 h后顷去培养皿内种植培养液，改用饲养培养液(同第二节)培养。以后每周换液2次，每次更换50%新鲜培养液。

2、新生大鼠脑腺垂体细胞的生长形态特征

接种后24h，新生大鼠脑腺垂体分散细胞即开始贴附在胶元薄膜上生长，脑腺垂体细胞最初分散或聚集成小团，随后迅速分裂增殖。细胞境界清楚，形状不规则，有圆形，卵圆或多角形。核位于胞体中央或偏于胞体一侧，可见1-2个核仁。随着培养时间的延长，脑腺垂体细胞胞体逐渐增大，形成单层，铺满皿壁底层。脑腺垂体细胞可持续培养1个月。

十三、神经胶质细胞培养

（一）雪旺细胞

雪旺细胞（Schwann cell，SC）是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞；它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能反应性分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞也能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。

1、材料和方法

雪旺细胞培养取材于各类哺乳动物的外周神经和背根神经节，取孵化8-12d鸡胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿，在无菌条件下用解剖镊分离出神经节，剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培养液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中，种植密度为0.2×10⁵个细胞/ml，每皿2ml细胞悬液置。置36℃、10%CO₂培养箱中培养。接种第3 d，在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以进一步去除成纤维细胞，作用48小时后更换新鲜培养液，以后每周换液两次，每次更换一半新鲜饲养培养液。

2、雪旺细胞的生长和形态特征

培养15d后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双极梭状，核卵居中，相互平行排列，经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。

编辑: cq

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