平滑肌细胞培养方法

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发布日期：2012-02-17 15:09 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 平滑肌细胞 　 点击次数：

1.2.2　胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养：细胞生长融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化传代。先将胰蛋白酶放入37℃水浴箱预热。用吸管将组织块从培养瓶底轻轻吹打下来，可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养。用无血清的培养液将培养瓶底冲洗两遍，洗掉残留的血清，然后迅速加入预热的胰蛋白酶，放回培养箱，每隔2 min观察一次，并轻轻拍打培养瓶壁，使细胞从瓶底脱落下来，待镜下观察多数细胞收缩变圆后，向培养瓶中加入含血清的培养液，终止胰蛋白酶的作用，再用吸管轻轻吹打培养瓶底，使细胞脱落，然后将培养瓶中的液体移入离心管，500 r/min，离心10 min后，弃上清液，然后加入含有10%胎牛血清的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液，按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶，放回培养箱继续培养。

1. 2.3　血管平滑肌细胞的鉴定

取常规传代的细胞，制成均匀的细胞悬液后，移入放有盖玻片的培养皿中培养，待细胞贴壁伸展，生长良好后取出盖玻片，用PBS冲洗2遍，凉干，放入4%的多聚甲醛中固定，30% H₂O₂1份+纯甲醇50份混合，灭活内源性过氧化物酶，然后热修复抗原，再分别滴加5%BSA封闭液、一抗[即抗平滑肌α-肌动蛋白（α-actin）的单克隆抗体]、生物素化山羊抗小鼠IgG、试剂SABC，最后DAB显色，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

2　结果

2.1　体外培养的胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的形态观察　实验中观察到脐动脉组织块贴壁后5~7d可见有细胞以垂直方向从组织块周围游走出来（见图1），但并不是所有的组织块周围都有细胞游出，离组织块较远的区域也可以看到细胞，此为平滑肌细胞的漂移性生长特性（见图2），细胞形态多样，大小不一，多为长梭形、菱形或星形； 9~11 d细胞进入对数生长期，细胞生长加速，部分区域可见“峰-谷”样生长（见图3）；约2周左右细胞融合成片，甚至相互交叉生长形成多层可以进行传代培养。细胞用胰蛋白酶消化后呈圆形，传代接种于培养瓶4 h就有细胞贴壁，24 h后细胞伸展，细胞形态多样，胞浆丰富，仍然呈“峰-谷”样生长特性，细胞生长较快，5~7 d长满瓶底，可以进行传代。

本实验取材于脐动脉，采用贴块法成功培养出平滑肌细胞。脐动脉是中动脉，中膜中唯一的细胞是平滑肌细胞，内膜中唯一细胞的是内皮细胞，实验中只去除血管外膜，保留中膜和内膜，将中膜和内膜一起培养，摒弃了传统平滑肌细胞培养实验中单纯培养动脉中膜的模式，将平滑肌细胞和内皮细胞联合培养，不但节约了接种时间，而且减轻了对平滑肌细胞的机械损伤，更有利于原代细胞的游出。本实验将去掉内膜的组织块与未去掉内膜的组织块同时培养，比较发现，未去掉内膜的组织块首先游走出细胞，而去掉内膜的组织块生长周期很长，甚至组织块死亡，没有细胞游出。在原代培养时，可以看到内皮细胞从组织块中游走出来，但随着原代培养的进行，内皮细胞不断的被平滑肌细胞所覆盖，又因在传代过程中，内皮细胞处于最底层而不易被消化下来，所以内皮细胞被淘汰，平滑肌细胞得到纯化。另外，脐动脉为中动脉，内膜中的内皮是单层扁平上皮，很薄，只由一层内皮细胞组成，而中膜较厚，由10~40层环行排列的平滑肌细胞组成，显然，平滑肌细胞的数量占有绝对优势；而且参考相关资料和文献[6，7]，发现内皮细胞的培养大多数用酶解法，没有用贴法的，因此，不用担心此方法培养平滑肌细胞会被内皮细胞污染。

实验中发现，平滑肌细胞对温度要求特别严格，培养箱内的温度必须为（37±0.5）℃，而成纤维细胞在（35±0.5）℃就可以生长。另外，在原代培养中组织块的密度要尽量大，因为组织块之间可以产生微量的相互作用；而且所用的眼科剪必须锋利，以减少对组织块的机械损伤，还可以保持组织块周围的整齐，利于细胞游走出来。在原代培养换液时，为避免将组织块晃动下来，可以先将培养瓶翻转过来，换液完成后再将培养瓶翻转。在传代时，必须把胰蛋白酶的温度控制在37℃，使其活性最大，保证最大程度地把细胞消化下来。

06 江西医药 平滑肌细胞培养的综述

2.1平滑肌细胞培养技术

有文献认为组织块+酶消化法，能够缩短培养时间，更易获得大量较纯的原代细胞，方法是：将剪碎的平滑肌组织块用0.1%胶原酶37℃消化0.5～1h后，再接种于培养瓶壁上，37℃培养箱中静置2～4h，待组织块贴壁牢固后，再补加含胎牛血清的培养液，37℃继续静置培养。此种方法细胞游出贴壁时间比传统组织块法短1～2d，可能是由于组织块被胶原酶消化后其细胞间质变得疏松，细胞容易挣脱间质束缚而萌出的缘故[6] （唐槐静，段胜仲，等。胎儿动脉平滑肌细胞培养方法的研究。湖北医科大学学报，1999，20（2）：89）

2.2平滑肌细胞的生物学特性

2.2.1平滑肌细胞生长过程：不同种类的平滑肌细胞培养具有相似的生长过程。贴块法培养的平滑肌细胞，3～7d开始以垂直方向从组织块边缘迁移萌出；6～7d细胞进入对数生长期；7～10d当组织块中大部分细胞萌出后，组织块便自行脱离，其周围细胞密度更加增大，部分区域细胞相互接触交替生长，出现“峰-谷”结构（峰：即多层细胞丘，可达8～10层，谷：即稀疏排列的单层细胞处，甚至无细胞处），这是平滑肌细胞的特征性生长表现；10～14d细胞相互融合。传代细胞的生长特性与原代细胞基本相同，细胞传代的间隔期一般为6～9d，传代开始时细胞呈圆形，不透明，边缘清楚，而后逐渐伸展贴壁，透明度增高，周界不清，呈典型“峰-谷”样生长。

酶消化法培养的平滑肌细胞，培养1d后，大部分细胞已贴壁，换液后继续培养3d，贴壁细胞完全伸展，多数呈长梭型，细胞伸出较长的突起相互接触，部分区域可见典型的“峰-谷”结构，培养7～9d细胞铺满瓶底。培养细胞达铺满状态所需时间与细胞活力和细胞接种密度有关，细胞活力愈大，接种密度愈大，达到铺满状态所需时间愈短。

2.2.2平滑肌细胞形态学特征：许多研究证实，体外培养的平滑肌细胞具有与体内平滑肌细胞相同的形态学特征。倒置显微镜下观察细胞形态，未贴壁前细胞呈圆形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁，贴壁后细胞胞质透明，彼此融合在一起，细胞呈梭形或多角形，核居中央，呈椭圆形。透射电镜下观察，细胞呈不规则形态，核呈锯齿状，胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体，粗面内质网扩张，游离核糖体丰富，基膜下有密斑。扫描电镜下可见细胞呈带状，平行排列，细胞周边常发出许多丝状突起与相邻细胞的丝状突起交织成网状。此外，在细胞表面还可见许多疏密不等的小泡，可能为平滑肌细胞收缩运动时胞浆外突的形态表现。

 动脉平滑肌细胞培养的几个问题

组织块大小边缘密度翻面时间观察时间对原代细胞萌发的影响

对于贴块法的原代培养来源，由于细胞并非直接获得，而是从组织块边缘长出，其中有一“突破过程”，且细胞萌发后尚需一定的细胞密度才能使其存活、增殖，故组织块大小、边缘、密度均影响细胞萌出与否及细胞存活、增殖。公认的方法是将血管剪成1 mm²大小组织块[1~3]。张映娜等认为组织块0.5~2 mm²范围内，大小影响不大（可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁）[4]。但如组织块超过2 mm²将增加细胞萌出的阻力。而组织块边缘整齐、光滑、密度

亦对细胞生长起着重要作用。组织块边缘过度受损或毛糙不平及组织块密度过稀或重叠将使细胞很难萌出。作者认为剥除内膜、外膜时用力适中，避免机械拉伤，将镊子夹过处切去，剪切时力求一次剪断。切组织块时不要离开培养液操作，保持边缘湿润，组织块密度以中瓶（100 ml）铺放取自6~8只150~250 g大鼠胸主动脉剪碎组织为宜，而小瓶（70 ml）则以3~4只为佳，且相同重量的大鼠，以月龄较小者为优。翻面时间一般认为3~6 h，具体时间应根据上述影响因素摸索而定。一般5~7 d后观察可见细胞从组织块边缘呈放射状长出，但5 d内不宜移动，以免贴壁的组织块脱落，脱落的组织块很难有细胞的萌出。

适宜的消化

一般认为细胞传代消化以细胞成片收缩，变圆变亮，细胞间隙增大时为宜。它主要取决于胰蛋白酶的浓度，pH值、温度、作用时间，而各实验室报道不一[5~7]。过高浓度的胰蛋白酶达到适宜标准的时间短，仅数十秒，不易控制，易使消化过度，浓度过低达到适宜标准的时间过长，易严重损伤细胞膜，细胞难以贴壁。通过实践摸索，作者认为加入0.05%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液在温箱内孵育2~3 min即可达到合适的消化度，0.03%的胰酶和0.02%的EDTA混合液亦可达到同样效果，需及时取出观察，终止消化。实验中还应根据传代后死细胞多少而做适当调整。作者通过对大鼠主动脉平滑肌细胞培养的长期摸索与实践，优化培养方法，使组织贴块法更经济实用，为研究提供大量遗传性质均一、功能状态良好的细胞。

第一次传代时机

一般的培养方法是选取细胞达亚融合状态时进行传代[1~3]。但贴块法原代培养时细胞生长往往不均匀，经常是一些区域已长成致密细胞层，一些区域仍未见细胞生长，这种情况下，当整瓶细胞达亚融合时，致密细胞层已老化。作者通过摸索，认为当原代培养5~7 d后可移出孵箱观察，如培养液变黄可部分换药继续培养，每隔2 d观察一次。瓶中若有部分区域达到亚融合状态即可传代，或到10 d左右仍未达到亚融合状态，但达到50%左右融合亦可进行传代，为保证传代细胞密度可将细胞传至小体积培养与封闭培养相结合。

07 中医儿科杂志

1.2 细胞培养方法

1.2.1原代培养

Wistar大鼠20只，断颈处死后，浸泡在75%酒精中5 min，移入超净工作台，在无菌盒盖上迅速取

出心肺组织与胸主动脉，在含青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL的无菌PBS液的培养皿中，冲洗2次，迅速分离出主动脉和肺动脉，并仔细剥除纤维层和外膜。更换培养皿，用眼科剪沿纵行剖开，内膜面向上，用眼科弯剪自上而下轻刮2～3遍，以去除内皮细胞。然后再换培养皿，加1滴DMEM，反复剪切成1 mm³小块（剪切10 min左右）。每只大鼠血管组织块可接种3个25 mL培养瓶，瓶内加入3 mL含20%新生牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液，翻转湿润瓶底，然后瓶底向上，用尖吸管从培养皿粘吸出小组织块，摆放在培养瓶底，小块相互间距离以0.5 cm为宜。轻翻转培养瓶，令瓶底向上，置于37℃、5%CO₂培养箱3～5 h，使小块微干涸；然后轻轻翻转培养瓶，令瓶底向下，让培养液慢慢覆盖于瓶底上的组织小块，置培养箱中静置培养，3 d换1次培养液[1]。

1.2.2传代培养

待原代培养的细胞从组织块长出，数量增加至细胞长满瓶壁或占瓶壁60%～80%时，即可进

行传代培养。吸弃原培养液，向培养瓶中加入PBS液洗净残留培养液，加0.125%胰蛋白酶2 mL，在室温中将培养瓶放于倒置显微镜下观察。待细胞回缩变钝变圆、细胞间隙增大后，立即直立或翻转培养瓶，吸除消化液，用含10%新生牛血清的培养液终止消化，用尖吸管反复吹打瓶壁细胞，使之脱落瓶壁并形成细胞悬液，再分装接种入培养瓶，根据细胞密度按1：2或1：3分装，3 d换液1次，4～6 d再传代。

07中国心血管病研究杂志 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

1材料与方法

1.1材料SD大鼠体重90～120 g，雌雄不限，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。DMEM高糖培养基、新生牛血清购于美国GIBCO公司，胰蛋白酶购于美国Sigma公司，平滑肌肌动蛋白、SP-9000免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1原代培养颈椎脱臼处死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，超净工作台内开胸取胸主动脉，置于含有预冷PBS的培养皿中去除血污，获取干净光滑的血管段，去除外膜与内膜。在另一含少量培养液培养皿中，将中膜剪成1 mm²大小的组织块。用吸管将组织块贴于培养瓶底面，组织块间距2～3 mm。加20%新生牛血清的培养液2～3 ml，将培养瓶直立于37℃、5%CO₂培养箱中，待4～6 h后组织块与培养瓶黏附后，平置培养瓶，4～5 d后首次换液。

1.2.2换液方法

细胞换液主要根据细胞生长状况及培养液的颜色变化决定。当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变成黄色时，需换液。弃去旧培养液加PBS液2 ml清洗后吸弃，再加入适量新鲜培养液，也可进行半量或2/3量换液。

1.2.3传代方法

弃去旧培养液后，PBS液清洗2次。向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞间隙增大时，加含血清的培养液迅速终止消化。弃去瓶内液体，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液反复吹打瓶壁细胞，计数后分别接种到新的培养瓶内。

编辑: cq

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