各类细胞培养小结

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发布日期：2012-02-17 17:34 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

脾脏单个核细胞悬液的制备

(1) 大鼠断颈处死后，无菌取脾置于消毒平皿中称重

(2) 超净工作台上置10cm直径无菌平皿，加入5～10ml D-hanks平衡液 ，置一80目的不锈钢筛于平皿中，脾脏置于筛网中，用剪刀剪碎脾，用5ml玻璃注射器针芯轻轻捻磨脾脏，使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中， D-hanks冲洗一次；

(3) 用吸管吸取冲洗液，200目的钢筛过滤一次后收集至离心管中；

(4) 1000rpm，离心5～10min，弃上清；

(5) 加入约1ml双蒸水，吸管打匀后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液，然后加入大量D-hanks调节渗透平衡，以红细胞，但对白细胞没有影响；

用D-hanks液洗涤细胞2～3次，用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml链霉素、10%的胎牛血清的RPMI－1640重悬细胞，调节细胞浓度为5×106/ml，台盼兰染色检测细胞存活率大于95％；

(7) 接种至培养板或培养瓶中。

猪肺泡巨噬细胞的培养

1、细胞培养所用溶液及其配制

1×RPMI1640及：按照产品说明配制，过滤除菌，4℃保存备用。

新生牛血清：56℃灭活30min，-20℃保存备用。

2×10⁴U/ml青、链霉素液（双抗）：青链霉素各2×10⁶ U溶于100ml灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

10×Na₂EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na₂HPO₄-12H₂O 2.89g，KH₂PO₄ 0.2g，1%酚红溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml双蒸水中，NaOH调节pH至7.2~7.5，过滤除菌，分装，-20℃保存备用，使用时1∶10倍稀释。

7.5%NaHCO₃： 7.5g NaHCO₃溶于100ml双蒸水中，115℃高压灭菌15min，置4℃冰箱冷藏备用。

10% RPMI1640营养液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×10⁴U/ml双抗，用0.5% NaHCO₃或10% HCl溶液调节pH值至7.2~7.4。

2、将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS30.0ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，2000r/min离心10min，收集沉淀。洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的1×RPMI1640营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37度CO₂培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。

神经细胞培养

一．设备： 无菌操作设备。

二．大型设备CO₂培养箱：恒温5%、10%CO₂维持培养液中pH值。

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜，用于准确地取材。

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪，pH剂，天平等。

三．培养器皿及手术器械

1.培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2.培养板，24-40孔，可用于开放培养。

3.培养瓶；

4.吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5.各类培养液贮存器。

6.小型手术器械。

准备：

一.配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca²⁺, Mg²⁺ ）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。

二.培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶

三.消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH₂O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

（一）选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

（二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×10⁶），做电生理应为5×10⁵或更低。

（四）抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

大鼠心室肌微血管内皮细胞的原代培养

材料和方法

1.仪器：

手术器械一套，倒置显微镜（Leica）,CO₂细胞孵育箱（Heraeus），超净工作台（苏州净化设备有限公司），扫描电子显微镜（Hitachi）。

2.主要试剂

DMEM高糖培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105单克隆抗体（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗体（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗体（华美公司），抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品，其他试剂均为国产分析纯以上级别。

3.方法

3.1 植块法原代细胞培养[1]：

细胞培养瓶的处理[2]：选用50ml玻璃培养瓶，高压蒸汽灭菌，瓶底铺自制鼠尾胶（制作方法参见2），移入80℃烤箱烤干，临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。

选用80克SD大鼠（雌雄不限，购自复旦大学实验动物部），1%戊巴比妥钠（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，将大鼠移至超净台进行操作，止血钳固定四肢，逐层打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，由升主动脉处剪下心脏，放入D-Hanks平衡盐缓冲液中，冲净心腔中的血液，辨清心脏解剖结构，去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔，保留左心室，小心去除心内膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方，滴加1ml进口胎牛血清，均匀接种于处理过的50ml培养瓶中，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养，使其贴壁，4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶，约48小时后组织块周围有星形细胞长出，80至96小时组织块周围有大量细胞长出，去除组织块，继续培养36-48小时，待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代，取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。

（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。

编辑: cq

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