细胞培养污染的途径、危害及预防措施

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发布日期：2012-02-20 13:47 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 污染 防治 　 点击次数：

2.3.1　来源

培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。细胞被支原体污染后，支原体可以与宿主细胞形成一个共生体系，使污染不断扩大。一旦发生支原体污染，支原体和其它微生物会随着飞沫而不断传播。操作过程中移液，倾倒液体时都会产生具有潜在感染能力的飞沫，并沉积在接触到的表面。这种污染性飞沫能存活数天甚至数星期。此外，操作失误引起的交叉污染也是支原体污染的一个常见途径。人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体，如 M.buccale，M.faucium，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原体等。无菌操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。人体外周血、骨髓、淋巴组织原代培养中有可能发生发酵支原体的原发污染(primarycontamination)，这也证明支原体在分化细胞中较未分化细胞更易生长。随着培养技术的不断发展，人们已能培养来自不同物种如动物、植物、昆虫的各种细胞，同时也扩大了支原体及其它微生物的宿主范围。此外，某些支原体，如菜氏无胆甾原体科(Acholeplasmalaidlawii)、M.arginini、 M.hyorhinis、口腔支原体、唾液支原体能寄生不同的宿主，并能在培养体系中稳定增殖数年。牛血清中能分离到A.laidlawii、 M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源。由于无血清培养基中许多附加成分及试剂是从血清或其它生物制品中制备的，因此无血清培养体系并不能排除支原体污染的危险。尽管随着培养技术的进步，血清发生污染的可能性进一步降低，但只要有一个活的支原体能通过滤菌器，整个培养体系就会被污染。

2.3.2　危害

支原体通过产生代谢产物及消耗各种养分，如核酸前体及必需氨基酸，从而改变细胞的代谢状态。支原体可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原体可以利用尿素作为能源，这会使细胞代谢发生一系列改变，从而影响蛋白质、DAN、RNA合成以及嘌呤从头合成及补偿合成途径。污染时间的长短及核酸代谢改变决定了支原体污染造成的危害程度，导致细胞染色体断裂、重排、非整倍体的出现。随后，细胞的生长特性发生改变，使某些酶和细胞因子的产生增加，并表现出一些特殊的细胞功能，而其它一些细胞正常的功能则被抑制。某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜抗原成分。随着细胞膜成分的改变，细胞的形态及抗原性发生改变。细胞污染对研究工作带来的最大危害是由于错误的实验结果导致研究误入歧途。此外，支原体污染还会干扰细胞的筛选，如杂交瘤细胞生长受到抑制并丧失产生单抗的能力。

2.3.3　预防及控制

污染发生后首先应确定污染物的种类及污染的程度。为了能正确检测细菌或支原体的污染，应先撤去培养液中的抗生素。常规细胞传代培养中应用抗生素会导致:①掩盖了不很严重的污染;②导致了耐药菌的产生。每一种抗生素的抗菌谱都是有限的，而且许多抗生素仅是抑制细菌生长，而非杀菌剂。因为支原体无细胞壁，所以青霉素，头孢菌素等干扰细胞壁合成的抗生素对于支原体无效。菌检及支原体检测只有在撤去抗生素后才能进行。实验中若发生污染或其它问题应有详细的记录，并由经验丰富的专家分析，找出哪个环节出了问题，包括培养液的配置、实验室环境的保持和无菌操作过程等，从而不断完善操作规程，避免类似问题的现。此外，管理者还应制定细胞培养的各项规章制度，教育每一个实验人员遵守。实验室负责人应根据情况，制定修改各项规范的操作程序及人员培训计划。一般来说，随着实验室规模的扩大，细胞发生变异和污染的可能性增加了。因此，大型实验室应严格制定各项操作程序及规章制度。细胞培养中无菌操作需要清洁的工作环境、实验的合理安排、实验者熟练的操作技巧及强烈的责任感。只有通过不断地学习、训练，才能熟练掌握无菌操作技术。为了尽可能减少污染的发生，以常规检查的方式来监督是必要的。细胞培养中发生污染是不可避免的，我们的目的是尽可能减少污染的发生及危害。

根据美国实验室的调查报告显示，至少10%的细胞系存在支原体的污染。一旦发生污染，如果细胞有详细的记录，则污染引起的危害较小。我们可以根据细胞定期菌检记录拼弃最后一次细胞菌检阴，性后的实验结果。利用菌检阴性的细胞重新开始实验。如果仅偶尔进行菌检或采用非特异检测方法，尤其是支原体污染，那么确定污染的范围比较困难。因为所有的细胞系都有可能被交叉污染。一旦发生污染，所有未进行菌检的冻存细胞都必须进行菌检，以去除污染的细胞并明确污染发生的时间。

2.3.4　检测

由于支原体污染并不引起细胞外观的明显变化，故常规的支原体检测非常必要的。人们可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。因此，有必要对不同检测方法的灵敏度及局限性有所了解。

不同检测方法对送检标本的要求不同，如果标本不合格，将不可能获得正确的结果。血清、培养液或培养基附加成分在加工和储存过程中污染会在一6定程度上被稀释，影响检出率。间接检测法由于其敏感性较差，若不采用浓缩标本，则不适用于检测血清和培养液的污染。由于污染物的随机分布，因此仅进行一次检测通常会出现假阴性。如果标本中污染物浓度低于10个污染物/ml，随机抽取1ml标本进行检测可能有366%的假阴性率。增加1标本体积，浓缩标本有助于降低假阴性率。另一种假阴性的产生是由于污染物在试剂瓶，冻存瓶等容器中的分布不均所致。若20个样品中有一个被污染(5%的污染率)，检测所有20个样品，假阴率为。需要指出的是仅仅单次检测一个标本来3616%，判断有无生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分装液体前，就应当从原液中尽可能多取一点液体进行检测。如果不能做到这一点，则应该用标准方法选择多个标本进行检测。例如，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。

标本的处理与标本的选择同样重要。各种酶如胰酶、脂酶，强酸，强碱或其它化学物质会破坏支原体膜的脂质，使支原体丧失活力及膜的完整性。膜的完整性被破坏后，支原体内的蛋白酶及核酶释放，从而会干扰间接检测方法的结果。如果标本收集后不能当天检测，则应该尽快冻存标本以防止降解。

选择、处理检测标本的目的是尽可能发现潜在的污染。在细胞培养过程中就应考虑到支原体污染的检测。我们最好选用无抗生素培养，检测应尽可能离传代时间长一点，以便让任何潜在的污染物生长、繁殖。为防止支原体活力丧失，如果检测的是贴壁细胞，应采用刮除细胞的方法，因为胰酶或其它生化分离方法会降低支原体的活性。在选用合适的检测方法时，应考虑到支原体的滴度和活力这两个因素。直接培养法是最敏感的，但也是最耗时的检测方法，大约需28天。从理论上讲，只需一个有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。理想的直接培养法应采用多功能的培养基，以降低假阴7性率。为增加对低滴度和低活力支原体检出率，应采用有氧和无氧两种培养条件及几种传代方式。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照，而且耗时，操作繁琐，因而不适于大多数实验室。检测支原体污染的间接法包括CR、 ELISA、电子显微镜检查、DNA探针、DNA荧光染色及生化7分析法等。间接法能检测到10/L的滴度。通常情9况下，支原体污染后其滴度一般超过 10/L，故尽管间接法不敏感，但相对较精确。由于支原体的多样，表达不同特异性的抗原及酶，为生化及免疫检测8法带来技术上的困难。在选择PCR、 DNA探针等方法前，应考虑好选择合适的靶序列及引物序列。DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原5体检测的金标准。美国、加拿大、日本和欧共体国家生物制药及诊断的监督机构推荐使用这种方法。其基本原理在于利用不同的技术，多次检测，以弥补各种检测技术的缺陷，增加检测结果的可信度。

2.3.5 　控制及排除

控制支原体污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高压蒸气灭菌法消毒。所有细胞培养设备都应消毒，应严格遵守上述的各项规章制度及监督制度，直至所有潜在的污染源都被消除。细胞一旦被支原体污染，要将它清除是非常困难的。由于一些不可复得的细胞被污染，人们不得不设法清除污染，挽救一些珍贵的细胞。事实上，经支原体污染的细胞，在污染经处理被清除后，细胞原有的许多生物学特性，如基因的表达，抗原性和代谢特点也随之发生了相应的改变。排除支原体污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠体内接种、巨噬细胞吞噬、胰酶消化等方法，但没有一种方法是普遍有效的。所以在采用每一种方法时必须对其效果以及对细胞可能产生的毒性影响进行监测。

Del6Guidice和Gardella提出了一个有效的方法，其基本步骤包括首先分离、鉴定污染物及测定对抗生素的敏感性，然后使用至少两种敏感的抗生素进行处理。为增加排除污染的有效性，可以通过稀释以降低血清及其它促生长因子的浓度，从而降低细胞的密度。治疗后细胞应在无抗生素条件下培养若干代，以确定污染已被彻底清除。细胞培养过程中支原体污染不易察觉，细胞被支原体污染后清除非常困难，支原体污染的细胞在支原体被清除后，其细胞特性会发生很大改变，对研究结果造成严重影响因此，为了保证细胞培养体系免受污染的影响，关键是加强预防措施。

编辑: cq

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