开天辟地的PCR技术

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发布日期：2011-11-29 16:31 文章来源：杭州朗基
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PCR的发展历史：

PCR技术是由Kary Mullis博士于1983年发明的。Kary Mullis博士在美国加州的艾默理维尔市（Emeryville）的Cetus公司工作，这是最早的生物公司之一。Kary Mullis博士负责为其他科学家制备短的DNA，一天晚上当他在太平洋海岸公路骑摩托车游览时，忽然想到一种新的分析DNA的方法，就是发明一种新的可以扩增任何DNA片段的方法，也就是这一发明让他和Michael Smith一同赢得了1993年的诺贝尔化学奖。

Mullis曾在Scientific American这样描述这项发明: "Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat." （使用一个单分子DNA，PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子，反应很容易进行，只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备）。

PCR的定义：

PCR全称Polymerase chain reaction（聚合酶链式反应）是利用聚合酶在体外实现DNA复制的分子生物学技术。如同生物体内发生的DNA扩增过程一样，这一技术使少量的DNA分子呈指数级的放大，因此即使从单个细胞也可能得到扩增产物。原来对DNA的扩增要将感兴趣的片断插入载体中，然后在细菌中进行复制，因此需要数周的时间。PCR技术的发明简化了DNA分析操作，缩短了试验时间（数小时），使各类基因操作成为可能。

PCR用来扩增一定长度的特定DNA片段，此DNA可以是一个完整的基因，也可能仅仅是基因的一部分，但必须已知基因的完整序列或部分序列才能进行PCR操作。受目前技术条件的限制，PCR方法一般只能扩增出数千碱基（kb）的片段，但使用长距离PCR（Long PCR）可能成功扩增出10-40kb的片段。

PCR过程：

PCR过程常常由三步组成：

1. 变性：在这一步骤，双链DNA被加热到94-96℃（使用高耐热的聚合酶时可达到98℃），使双链DNA间的氢键被打断而分开成单链。在第一轮循环前，常要加上一段时间更长的变性步骤（时间1-5min），以保证较长的模板链完全分开，并且使干扰PCR反应的蛋白酶和核酸酶失活。当使用热启动聚合酶时，可能需要更长的变性时间5-20min，以使这些酶的活性完全释放。

2. 退火：在DNA解链后，降低温度，以使引物能与单链DNA模板链结合。退火原理：随着温度的降低，发生布朗运动的单链引物不断与单链模板相互碰撞，形成离子键，又不断发生解离。当引物结合到模板的互补区时，形成的离子键稳定存在的时间更成，这段小的双链区促使聚合酶结合上去并开始拷贝模板。一旦几个碱基结合上去，离子键强度即可升高到足以使形成的双链区不再被打断。退火步骤的温度主要由引物的Tm值决定，经常设在比Tm值低5℃左右，但最优的退火温度应通过试验确定；使用带有温度梯度功能的PCR仪可以通过1-2次实验来确定最优的退火温度。PCR过程设置的退火温度决定退火的特异性。Tm值是可设定的退火温度的上限，如果将退火温度设置为比Tm值稍低，那么引物和模板间只能发生最特异性的碱基配对，提高反应的特异性；但退火温度过高时，将降到产物的量；降低退火温度可提高产物的量，而退火温度过低时，引物将与模板链的其它区域发生非特异性结合，经过指数扩增产生大量非特异性产物。退火温度一般在45-68℃之间，时间1-2min。

3. 延伸：退火过后引物结合区已经结合了几个碱基，更强的离子键阻止链的打断，而同模板链匹配程度较低的引物结合区随着温度的升高而再次解离，不会产生非特异性产物。当温度升高到聚合酶的最适温度时，DNA聚合酶利用核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）为原料，在引物结合位点开始合成DNA新链。延伸的温度依赖于使用的DNA聚合酶的特性，一般采用72℃。延伸时间则依赖于DNA聚合酶和产物长度。一般来讲，每延伸1000个碱基，Taq酶需花费1分钟时间，高保真酶则需要更长的时间。经过一轮循环后，一条双链DNA模板变成两条双链DNA，这两条双链DNA又作为下一轮扩增的模板，第二轮循环两条双链DNA变成四条双链DNA，第三轮循环后形成八条双链DNA.... 随着循环的进行，产生越来越多的模板。变性、退火、延伸反应循环25-45次，最后产生几百万个DNA分子。

在最后一轮循环后，常需要一步后续延伸步骤，以确保剩余的单链完全合成为双链DNA。最后一步延伸时间一般需要5-10分钟。PCR反应精确的循环参数和条件必须通过实验来确定。

PCR产物的检测：

PCR扩增的成功与否主要通过琼脂糖凝胶电泳方法来确定。将5-10微升PCR反应物点样到经EB（Ethidium bromide）染色的1%的琼脂糖凝胶中，并且使用已知浓度和条带大小的分子量标准品同时电泳。扩增产物在紫外光下应呈现单一的条带，且条带大小与预期的大小一致。如果有多条条带存在或者条带弥散或者亮度很弱，则要对PCR条件做进一步的优化，甚至要重新设计引物。扩增产物的量可通过与分子量标准品的条带亮度相比较来估计，或者使用微量分光光度计测定260nm处的吸光度来得出，使用特异性的双链DNA结合染料结合产物后采用荧光分光光度法进行定量可使定量更准确。

PCR的应用：

PCR技术对于检测低拷贝数的样品、珍贵的样品、难以培养或需要长时间培养的生物特别有用。在微生物和分子生物学实验室PCR技术可用于克隆、分子杂交、测序和重组DNA技术、DNA指纹图谱分析等，通过在引物中引入与模板链不同源的碱基而可进行位点介导突变操作（Site-directed mutagenesis）或使用简并引物扩增不同物种的基因，从而了解物种间的进化关系；在临床微生物实验室，通过PCR技术能检测受到微生物或病毒感染的病人经治疗后的预后效果，了解不同病人对治疗的反应情况，也可用于检测遗传疾病。在法证实验室，由于从一滴血或一根头发能扩增出足够的DNA，因此PCR技术特别有用。

PCR仪介绍：

PCR过程要使用基因扩增仪来进行。基因扩增仪也称作热循环仪（Thermo cycler），简称PCR仪，通过控制周期性的迅速加热和冷却含有反应液的PCR管，为PCR过程提供准确的温度条件。为阻止反应液的蒸发，目前的基因扩增仪常配备有热盖，热盖可通过加热反应管的顶部维持特定的高温（常常达到105℃左右），起到阻止反应液的蒸发的效果。对于没有热盖功能的基因扩增仪，可在反应管的反应液上覆盖一层矿物油，以达到阻止反应液的蒸发的效果。

编辑: cq

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