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多个产物或非特异性扩增产物

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发布日期：2011-11-30 11:47 文章来源：杭州朗基
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关键词： 丁香园 生物专题 杭州朗基 PCR 产物 　 点击次数：

反应成分问题：

可能的原因 解决办法
   反应管或试剂污染    1. 将反应管使用前进行高压灭菌，消除污染的核酸
   2. 使用新鲜的溶液和试剂以及新的反应管
   外源DNA污染    1. 配置反应液时，使用专用的工作区和移液器
   2. 配置反应液时，戴手套操作
   模板过量    1. 通过电泳检查模板的浓度
   2. 减少起始模板，对于低复杂度的模板（例如质粒、lambda、BAC DNA），每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于高复杂度的模板（例如基因组DNA），每50ul反应使用1ng-1ug DNA
   引物退火温度太低    提高退火温度
   Mg离子浓度过高    在1.5-4mM区间按0.2-0.25mM的间隔降低Mg离子浓度
   引物设计的不好    1. 查找与本序列相关的文献所设计的引物
   2. 确保引物有更高的退火温度
   3. 确保引物内和引物间不存在互补
   4. 如果原来的引物长度<22碱基，增加引物长度
   5. 避免3’端过多的GC
   6. 如果原来引物的GC含量少于40%，设计GC含量在40-60%范围的引物
   模板DNA上存在多个引物结合位点    重新设计更高特异性的引物
   引物简并度过高    降低引物简并度
   引物过量    在0.05-0.1-0.5-1uM浓度范围内调节引物浓度
   引物质量问题、不纯    只使用高质量的、纯化过的引物
   dNTPs过量    减少dNTPs
   聚合酶浓度太高    减少酶浓度
   pH条件不够优化    检查更高或更低的pH值
   反应缓冲液未混匀    充分混匀反应缓冲液

 

反应条件问题：

可能的原因 解决办法
   PCR反应前的预复制    1. 使用热启动聚合酶
   2. 在冰上配置反应混合物，待热循环仪预热到变性温度时再放样品
   变性温度太高或太低    按1℃的变化量调节温度
   退火温度过低    1. 使用可靠的方法重新计算引物的Tm值
   2. 按2-3℃的变化量增加退火温度
   延伸时间太长    较少延伸时间
   循环数过多    减少循环数
   Ramp速率太低    提高Ramp速率

 

策略：


      1. 使用巢式引物
      2. 使用两步PCR
      3. 使用热启动
      4. 使用降落PCR

编辑: cq

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