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寡核苷酸的消光系数和分子量

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发布日期：2011-11-30 13:41 文章来源：杭州朗基
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关键词： 丁香园 生物专题 杭州朗基 PCR 寡核苷酸 　 点击次数：

摘自TriLink《An Introduction to Extinction Coefficients and Molecular Weights of Oligonucleotides》
作者Judy Ngo and Shawna Oliva; TriLink BioTechnologies

一般来讲，引物合成单都会提供对于寡核苷酸使用来说两个关键的数据：消光系数（Extinction Coefficients）和分子量（MW）。这两个数据用来计算重要的数据，例如确定摩尔浓度和制备储液。本文将解释什么是寡核苷酸的消光系数（Extinction Coefficients）和分子量（MW）、讨论数据的推导来源、并就怎样使用这些数据给出一个例子。

 光密度单位（optical density unit），更普通的叫法是OD260，源于按分光光度法测量寡核苷酸。核酸链的每个碱基由于自身存在的共轭双键系统，都有一个260nm或接近260nm的吸光度。因为准确的碱基序列和组成是已知的，使用OD260单位能很精确和方便的定量寡核苷酸。OD260测量单位定义为使用1cm的光径、测量260nm波长处、 1ml寡核苷酸溶液产生读数为1.0时需要的寡核苷酸浓度。使用吸光度测量是定量或分装寡核苷酸的推荐方法。由于寡核苷酸的重量太少，不能用天平精确地称量，并且分光光度法测量能精确的测量而不受样品中过量的盐的干扰。吸光度读数也确保复合物使用前是完全溶解的。

 OD260和存在的寡核苷酸量的数学关系使用到一个物理常数，即消光系数。消光系数是Beer定律A＝εCl中的系数（A是吸光度、C是浓度、l是光径长度、ε是消光系数），消光系数是待分析的物质的常数。消光系数考虑到每个独立碱基的吸光度、也考虑相邻碱基的效应。因为消光系数依赖于精确的核苷酸组成和序列，对于每个寡核苷酸来讲消光系数是唯一的。有几种方式可以确定寡核苷酸的消光系数，临近方法“nearest neighbor”相比普遍使用的仅仅将各个碱基的消光系数加和的方法更加准确。

 引物合成单上的消光系数表达为ODs/µmol，这一单位是标准消光系数单位L mmol-1cm-1经数学推导而来。请注意，即使使用临近方法“nearest neighbor”计算的消光系数相对准确，其结果也可能与真值相差最高可达10%。

 引物合成单上出现的另一个重要数据是分子量。寡核苷酸的分子量是化合物每mol（6.02×1023个分子）的克数，是寡核苷酸可能包含的每个原子的分子量总和。分子量数据用来将OD260单位转化为质量单位，寡核苷酸的分子量一般是指其自由酸根形式的分子量。

 一般的引物合成单会使用OD260单位代表最终的寡核苷酸产量，所以理解怎样使用OD260单位来转化为其它单位非常重要。以下是将OD260转化为其它普遍使用的单位的例子。

寡核苷酸单位转换：

样本序列：

5' AGC TAA GTC ACT GCC ATT GA 3'

   消光系数Extinction Coefficient (ε)*：    195.5 OD units/µmole
   分子量Molecular Weight (MW):：    6101.0 g/mole
   OD (A260 )：    32.4

*如果使用L mmole-1 cm-1作为消光系数的单位，则首先需要将其转换为OD units/µmole单位：ε L mmole-1 cm-1 ÷ 1000 = ε OD units/µmole

195,500 L mmole-1 cm-1 ÷ 1000 = 195.5 OD units/µmole

例子1：转换为µmoles

µmoles of oligo  = OD (A260) ÷ ε
   = 32.4 ÷ 195.5 OD units/?mole
   = 0.166 µmoles

例子2：转换为µg

(使用例子1计算得到的µmoles量)

µg of oligo   = µmoles × MW
   = 0.166 µmoles × 6101.0 g/mole
   = 1012.8 µgrams

编辑: cq

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