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产物条带很淡

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发布日期：2011-11-30 12:46 文章来源：杭州朗基
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关键词： 丁香园 生物专题 杭州朗基 PCR 产物 　 点击次数：

反应成分问题：

可能的原因 解决办法
   加样误差    重新进行PCR实验，确保没有加样误差
   引物降解    重新订购引物
   引物设计的不好    避免倾向形成发夹环或二聚体的引物
   引物浓度过低    增加引物浓度，引物浓度可在0.1-0.5uM范围内按0.1的变化量变化
   引物浓度不平衡    确保引物浓度相等
   模板浓度过低    1. 通过电泳检查模板浓度
   2. 增加模板浓度
   模板量过多，过量的模板可结合所有的引物从而抑制反应    减少模板的量
   聚合酶的量过少    按0.2U的变化量增加聚合酶的浓度
   使用的聚合酶不合适    试用不同的聚合酶
   Mg离子浓度太低，抑制酶的活性    增加Mg离子浓度以降低退火的严谨性，Mg离子浓度可在1.5-4mM范围内按0.2-0.3的变化量变化
   dNTP浓度过低    增加dNTP，dNTP的正常浓度范围是20-200uM
   缓冲液(KCl)的浓度不合适    调节缓冲液(KCl)的浓度(产物<1000bp时提高浓度；产物>1000bp时降低浓度)

反应条件问题：

可能的原因 解决办法
   预变性不足    增加预变性的温度或时间
   变性温度过高或过低    按1℃的变化量调节温度
   变性时间太长或太短    按5秒的变化量调节温度
   退火温度过高    1. 使用可靠的方法重新计算引物的Tm值
   2. 按2℃的变化量降低退火温度，退火温度起点设在比两引物的最低Tm值低5℃
   退火时间太短    按15s的间隔增加退火时间
   延伸温度过高    按2℃的变化量降低延伸温度
   延伸时间不足，特别是扩增长片段时    每扩增1kb的产物延伸时间为1-2min
   最后的延伸时间不足    增加最后的延伸时间
   循环数不够    按3-5个循环的变化量增加循环数
   矿物油质量问题    使用高质量、无核酸酶的轻质矿物油。不要使用高压灭菌过的矿物油

 

策略：

1. 将PCR产物稀释10-100倍后进行第二次扩增。
      2. 将PCR产物稀释10-100倍后，使用Nested PCR扩增提高灵敏度。 

编辑: cq

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