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无扩增产物

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发布日期：2011-11-29 17:04 文章来源：杭州朗基
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关键词： 丁香园 生物专题 杭州朗基 PCR 扩增产物 　 点击次数：

反应成分问题：

可能的原因 解决办法
   设计的引物不够好    1. 查找与本序列相关的文献所设计的引物
   2. 确保引物内和引物间不存在互补
   3. 增加引物长度
   引物特异性不够    确保引物同靶序列完全互补
   引物浓度不够    引物浓度可在0.05-0.1-0.2-0.5-1uM范围内按0.1uM的变化量优化
   漏加试剂    扩增阳性对照以确定试剂没有漏加，重新配制反应混合物
   试剂过期或储存不当或浓度不对    扩增阳性对照以确定试剂没有问题：例如新合成的引物可能有问题
   dNTP降解    dNTP对反复冻融很敏感。将dNTP分成小份冰冻保存，迅速融化并立即置于冰上；避免反复冻融
   引物降解    重新订购引物
   模板质量不够好、降解    1. 使用更多的模板
   2. 通过凝胶电泳分析DNA片段的完整性
   3. 当扩增较长的产物时，确保模板没有降解 使用新分离的模板
   模板浓度太低    1. 通过电泳检查模板浓度
   2. 增加模板浓度
   存在反应抑制物; 反应管污染抑制物    1. 通过乙醇沉淀或使用清洁试剂盒进一步纯化模板
   2. 降低加入的模板量，或将模板用10mM Tris-HCl (pH8.0)稀释5倍后使用，或加入BSA
   3. 使用新的反应管、将管子高压灭菌后使用
   模板复杂    按1％的变化量添加DMSO、增加预变性温度和时间
   靶DNA上不存在引物结合的靶点    换用其它来源的靶DNA
   反应缓冲液的pH过高  
   缓冲液没有稀释   增加水

反应条件问题：

可能的原因
Possible Cause		 解决办法Solution
   变性温度过高或过低    按1℃的变化量调节温度
   变性时间太长或太短    按5秒的变化量调节温度
   退火温度过高    1. 使用可靠的方法重新计算引物的Tm值
   2. 按2℃的变化量降低退火温度，退火温度起点设在比两引物的最低Tm值低5℃
   循环数太少    按3-5个循环的变化量增加循环数
   PCR程序设定不正确    检查程序，确保时间和温度正确
   样品台温度不一致，一些位置的温度过低    检查校准样品台加热能力。使用阳性对照来确定某些位置的产率过低

 

编辑: cq

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