转录组测序
转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。相对于传统芯片而言，转录组测序无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
技术路线
Roche 454高通量测序平台和Illumina Solexa高通量测序平台均可对转录组进行测序，由于两种平台各有其优缺点，针对不同的样品情况，需灵活选用。Roche 454测序技术的优点是单序列读长可以达到500bp，在未知基因组序列物种的转录组分析中更有优势，其较长的读长便于拼接，能获得更好的转录本数据。Illumina测序技术的优点是单次测序获得的数据量大，能够得到更高的覆盖率，检测到更多低丰度的转录本，在已知基因组序列物种的转录组分析中更具优势。
1. 有参考基因组的转录组分析（Transcriptome analysis with reference genome）
2. 无参考基因组转录组分析 （De novo Transcriptome Analysis）
1) 方案一
提取总RNA后分离mRNA，合成cDNA链并构建454测序文库，然后使用Roche 454进行高通量测序。技术优势：① 454的测序读长长，数据聚类拼接质量高；② 可以进行表达差异分析（两个或两个以上样品）。
2) 方案二
提取总RNA后分离mRNA，合成cDNA链并进行均一化处理，构建454测序文库，然后使用Roche 454进行高通量测序。技术优势：① 454的测序读长长，数据聚类拼接质量高；② 构建均一化文库，相同的测序数据量可以获得更全面的转录本信息。
3) 方案三
提取总RNA后分离mRNA，合成cDNA链并构建Illumina测序文库，然后使用Illumina Solexa进行高通量测序。技术优势：① 高数据通量，可以检测到几乎所有的转录本；② 可以进行表达差异分析（两个或两个以上样品）。
生物信息分析
1. 无参考基因组转录组分析 （De novo Transcriptome Analysis）
1) 测序原始数据处理（质量剪切、污染序列去除等）
2) Contig和Unigene统计分析
3) Unigene功能注释（NR、GO 和KEGG等）
4) SNPs及SSR分析等
5) 表达差异分析（不少于两个样品）
2. 有参考基因组的转录组分析（Transcriptome analysis with reference genome）
1) 测序原始数据处理（质量剪切、污染序列去除等）
2) 短序列mapping至参考基因组序列
3) 基因功能注释
4) 基因结构分析
5) 可变剪切分析
6) 差异表达基因分析
7) 预测新的基因
成功案例
美吉生物已成功完成包括线虫、牡蛎、对虾、蜜蜂、鲫鱼、鲤鱼、鸡、猪、油菜花、菊花、桃树等多个物种的转录组测序及分析。
实验周期
美吉生物从获得合作伙伴样品、文库制备、高通量测序到数据分析，一般控制在30到40个工作日内完成。
送样要求
1. 动物、植物、微生物
1) 请提供总量大于2g的新鲜样品；植物材料应尽量选取幼嫩部位，避免过老的组织。
2) 采样后将样品立即用液氮速冻，保存于－80℃（保存期不超过1个月），送样时使用干冰运输（不超过72h）。
3) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
4) 样品保存期间切忌反复冻融。
5) 样品质量合格与否的判断标准：RNA提取后经变性电泳，各RNA条带清晰，比例适中，完整性好，无降解。
6) 请填写完整的送样订单，并提供尽量详细的物种基因组背景资料信息，如基因组大小，基因平均长度，预计表达的基因数量等。
2. RNA
1) 请提供请提供OD260/280介于1.8～2.2之间，浓度≥250ng/μl，总量≥40μg的总RNA，并确保RNA无降解，无污染；或提供浓度≥50ng/μl，总量≥400ng的mRNA。
2) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
3) 样品保存期间切忌反复冻融。
4) 送样时使用干冰运输。
5) 质检以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。
6) 请填写完整的送样订单，并提供RNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。
3. 双链cDNA
1) 请按照美吉生物提供的cDNA 454文库构建流程进行文库构建，去除文库中的Poly A。
2) 总量＞5μg，浓度＞50ng/μl，OD260/280在1.8左右。
3) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
4) 样品保存期间切忌反复冻融。
5) 送样时使用干冰或冰袋运输。
7) 请填写完整的送样订单，并提供cDNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。
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编辑: helen
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