miRNA研究方法

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发布日期：2011-09-21 15:34 文章来源：欧易生物
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尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。

下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。

miRNA主要研究技术

深度测序   抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。

miRNA芯片    利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。

q-PCR   q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。

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Mimics以及Antogomirs  通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。

萤光素酶报告系统   在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。

miRNA的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA表达谱，Northern Blot或核酸原位杂交检测miRNA的表达，miRNA克隆、测序等等。另外，在miRNA研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具--生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。

miRNA研究中常用的软件和数据库资源

以下是常用的microRNA靶标数据库和软件资源列表，希望对microRNA的研究者有所帮助。

（1） miRbase：众所周知的microRNA基因注释数据库。目前miRBase只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。 网址：http://mirbase.org/index.shtml

（2） starBase：一个高通量实验数据CLIP-Seq（或称为HITS-CLIP）和mRNA降解组测序数据支持的microRNA靶标数据库，整合和构建多个流行的靶标预测软件的交集和调控关系。网址：http://starbase.sysu.edu.cn/

（3） Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。网址：http://microrna.gr/tarbase/

（4） miRecords：一个整合的microRNA靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址：http://mirecords.biolead.org/

（5） targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。而且是microRNA领域大牛Bartel实验室开发的。网址：http://www.targetscan.org/

（6） PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA领域大牛Rajewsky实验室开发的。该文章位列miRNA相关文章引用Top5。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/

（7） PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility）和自由能预测microRNA的靶标。是著名的生物信息学家Segal实验室开发的。网址：http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html

（8） RNA22：基于序列特征预测microRNA的结合位点。是几个流行的microRNA靶标预测软件的其中一个。IBM公司的研究团队开发的。网址：http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html

（9） miRanda和microRNA.org：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中心的研究人员开发的软件和数据库。miRanda的最新版本又叫mirSVR。网址：http://www.microrna.org/microrna/home.do

（10） MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 实验室开发的microRNA靶标数据库。网址：http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/

（11） miRTarBase：整合实验证实的microRNA靶标的数据库。网址：http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html

（12） miRGator v2.0：整合microRNA表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址：http://mirgator.kobic.re.kr:8080/MEXWebApp/

（13） MiRNAMap:动物的microRNA基因及其靶标的数据库。网址：http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/

（14） miRDB: 动物microRNA靶标预测和功能注释数据库。网址：http://mirdb.org/miRDB/

（15） RNAhybrid：一个基于miRNA-target配对自由能预测microRNA的靶标的软件。网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/

（16） miRGen：microRNA基因和microRNA靶标数据库。网址：http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html

（17） Targetfinder: 使用基于植物的靶标罚分策略预测小RNA的靶标软件。网址：http://jcclab.science.oregonstate.edu/node/view/56334

（18） miRU, psRNATarget: 一个网页版的植物microRNA靶标预测工具。网址：http://www.plantgrn.org/psRNATarget/

（19） CleaveLand:一个基于mRNA降解组数据预测microRNA靶标的工具。网址：https://homes.bio.psu.edu/people/faculty/Axtell/AxtellLab/Software.html

（20） Target-align：一个就鉴定植物microRNA靶标的工具。网址：http://www.leonxie.com/targetAlign.php

编辑: helen

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