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内参
内参在生物学研究中非常常见。例如RT-PCR或western blot实验中常用表达量稳定的管家基因/蛋白作为评估不同样本之间目标基因或蛋白变化的参考。以western blot为例，如果加药处理前后GAPDH或tublin、actin等基本没有变化，而目标蛋白表达变化明显，则说明“加药”过程中目标蛋白的表达受到影响。内参的引入可以排除上样量不同或样本处理过程中的偏差导致的可能误差···

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miRNA研究技术---MicroRNA实时定量PCR

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发布日期：2011-09-21 17:05 文章来源：欧易生物
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实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

欧易技术平台使用ABI7900、ABI 7500和Biorad IQ5.0型实时荧光定量PCR仪，用染料法或Taqman探针法对microRNA进行real time PCR定量测定或定性鉴定。灵敏度高、线性范围宽、特异性好、重复性佳。（详情请关注http://www.oebiotech.com）

技术原理

技术特点

加尾法

样品量

1µg total RNA

反转录

通用反转录引物

qPCR

Sybrgreen法

通量

可同时检测数十个miRNA

特点
  • RNA加尾和引物延伸法，样本用量少（1µg）且不需分离miRNA
  • 采用通用反转录引物，一次反转录产物可用于上百个miRNA检测
  • 检测通量高，可同时检测数十个miRNAs
  • 不同末端成熟miRNA都能被加尾和反转录，保证定量准确性
  • 配合QIAGEN试剂盒，保证实验可靠性

扩增产物特异性高，通过产物热解离曲线（融解曲线）判断

茎环法

样品量

1µg total RNA

反转录

特异反转录引物(茎环)

qPCR

Sybrgreen法

通量

客户需要的microRNA

特点
  • 高特异性——只对成熟MicroRNAs进行定量，而不受其前体干扰
  • 快速，简单——整个操作只需两步，不到3个小时，即可获得高质量的数据
  • 灵敏——样品消耗少，仅需1-10ng的total RNA或同等物
  • 超宽的线性范围——可跨越7个数量级

Taqman探针法

样品量

1µg total RNA

反转录

特异反转录引物(茎环)

qPCR

Taqman 探针法

通量

客户需要的microRNA

特点

 
  • 准确性高
  • 特异性强：只检测成熟的microRNA，而不检测其前体及基因组DNA
  • 快速简单：容易操作,3h内就能得出高质量的结果
  • 灵敏度好：对常规样品的检测只需要1~10ng的总RNA
  • 重现性佳：具有很高的准确性和重现性
  • 宽广的动力学范围：即可检测几拷贝到几百万拷贝的人工合成miRNA或几匹克到几十纳克的总RNA。 

样本要求

客户可提供组织（>100～200 µ g）、细胞（>106），血液（1ml）、血浆或血清（1ml）、总RNA (>1µg)，用于miRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase 污染（降解样品不易定量，材料允许情况下，尽可能不用已降解的RNA），提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。同时请提供尽可能详细的背景资料，包括样品来源、miRNA丰度、miRNA名称或序列等。

服务特色

♦  多样的样品：石蜡、组织、细胞、血液、血浆或血清等；

♦  丰富的检测手段：加尾法、茎环法、Taqman探针法等；

♦  先进的设备：ABI7900、ABI 7500和Biorad IQ5.0型实时荧光定量PCR仪。

编辑: helen

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