DIGE文献实例
文献实例（2D-DIGE）
双向荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE）应用于拟南芥对赤霉素反馈机制的研究（Molecular & Cellular Proteomics 2007）
Carnegie协会的研究者通过前期实验发现，内源赤霉素（Brassinosteroids, BR）匮乏拟南芥样品det2在含有100nm BR的培养液和不含有BR的相同培养液中整体生长情况有较大不同。通过测量样品的鲜重（Fresh Weight）和胚轴长度（hypocotyl length），观察到BR处理的拟南芥样本在6h就已经明显高于对照样本，在24h这两个指标已经是对照样本的2倍。这些结果说明BRs可以明显促进植物细胞的生长。
A：BR处理det2（左）和对照样本(右)的生理状态；
B：BR处理（BL）和对照（Control）样本的鲜重（Fresh Weight）检测图；
C：BR处理（BL）和对照（Control）样本的胚轴长（Hypocotyl Length）检测图。
那么BR促进细胞生长的分子机制是什么呢？2D-DIGE检测和LC-MSMS鉴定共发现42个蛋白质在BR处理下发生显著性变化。这些蛋白质中包括3个细胞骨架蛋白质、几个与激素或维生素合成的相关蛋白质以及一些与细胞板形成相关的蛋白质。在这42个BR调控蛋白中，是否也存在与BR信号调节相关的蛋白质呢？
BR调控蛋白的2D-DIGE分析
研究者带着上述疑问，进行了两次2D-DIGE补充实验。其中一个实验是在对BR迟钝型拟南芥品种bril-116 和野生型中进行的，发现了31个在bril-116 中显著上调表达的蛋白质，25个在野生型中上调表达的蛋白质。另外一个实验是在对BR敏感型拟南芥突变品种bzr1-1D 和野生型中进行的，发现有19个在bzr1-1D 中显著上调表达的蛋白质和27个在野生型中显著上调表达的蛋白质。
通过维恩图分析发现有10个蛋白质在对这3次2D-DIGE实验（det2、bril-116和 bzr1-1D）均为显著差异性表达。这10个蛋白分别为：PATL2、PATL1、PHS2、NADP-ME2、MDAR3、THI1、GSTU17、GSTF2、GSTF9和CABP-22。
A：3次2D-DIGE实验（det2、bril-116和 bzr1-1D）均为显著差异性表达的10个蛋白质；
B：3次2D-DIGE实验（det2、bril-116和 bzr1-1D）所有差异蛋白质维恩图分析。
根据已有的研究，PATL1和PATL2参与到肌醇类物质的磷脂酰过程，与细胞板的扩张密切相关，这从一个侧面说明了BR通过刺激PATL1和PATL2的高表达来促进细胞的生长。基于这些特点，研究者选择了PATL1和PATL2在det2 2D-DIGE实验进行了WB验证，发现在随着BR处理时间的延续，PATL1和PATL2的表达量一直持续表达，这个结果一方面验证了本研究中2D-DIGE数据结果是可靠地，另一方面进一步说明了PATL1和PATL2在BR反馈机制的重要性。
蛋白质PATL1和PATL2 WB的验证实验
对于蛋白质THI1，先前的研究已表明THI1主要是参与到绿色植物重要光合作业物质叶绿色（chlorophyll）的形成，在该研究的2D-DIGE结果发现叶绿色含量的降低可能是通过抑制THI1表达量来实现的。为了验证这个实验结果，研究者进行了THI1的基因敲除实验，对基因敲除得到的突变材料（thi1）进行2D-DIGE发现THI1所对应的蛋白点没有出现。随后再次对突变材料thi1和野生型Col进行BR处理的各自2D-DIGE对比实验，两次实验之间除了THI1所对应蛋白质点的有无区别之外，在该点周围的相关区域的蛋白质点没有发生任何的变化。这些结果再次证明了THI1蛋白质与BR调控的相关性。
A：基因敲除突变型thi1和野生型Col 2D-DIGE图谱中THI1蛋白点对比图；
B：野生型Col在BR处理和空白对照 2D-DIGE图谱THI1蛋白点所在区域对比图；
C：突变型thi1在BR处理和空白对照 2D-DIGE图谱THI1蛋白点所在区域对比图。
研究者随后对det2和 bzr1-1D的2D-DIGE得差异蛋白质进行了所对应mRNA表达水平的相关性分析，发现det2 和bzr1-1D 的相关系数分别为0.19和0.30，处于中等相关水平，说明BR对植物生长的转录后调控作用的加强。同时研究者以蛋白质THI1、ACO、AOC和SAMS为例分析了蛋白质和mRNA的相关性。
A：det2 2D-DIGE实验所得差异蛋白质与对应mRNA的相关性分析图；
B：bzr1 2D-DIGE实验所得差异蛋白质与对应mRNA的相关性分析图；
C：蛋白质THI1在det2 2D-DIGE实验中与mRNA的相关性分析图；
D：蛋白质ACO在det2 2D-DIGE实验中与mRNA的相关性分析图；
E：蛋白质AOC在det2 2D-DIGE实验中与mRNA的相关性分析图；
F：蛋白质SAMS在det2 2D-DIGE实验中与mRNA的相关性分析图。
研究者最后利用2D-DIGE的实验优势，对蛋白质的磷酸化水平进行的分析（蛋白质在磷酸化后其分子量和等电点有细微变化，这个变化在2D-DIGE实验中可以被检测到）。基于该点，研究者发现了蛋白质BiP2在det2和 bzr1-1D 实验中有翻译后修饰的情况。例图中，1-4号点进LC-MSMS鉴定为均为BiP2蛋白质，但是这4个点的丰度却有较大的差别。随后研究者利用Pro-Q Diamond和Cy5最小标价法对该4个蛋白点的磷酸化水平进行了分析，发现3号点没有磷酸化；1和2号点有磷酸化修饰；4号点的磷酸化水平在减弱。鉴于4号点是det2和 bzr1-1D 2D-DIGE 实验的差异点，研究者推测BiP2磷酸化作用在BR刺激反应中有减弱的现象。
在文章最后的讨论部分，作者指出了蛋白质PATL1、PATL2、THI1和BiP2在植物应对BR刺激反馈机制中有很重要的调节作用。同时指出2D-DIGE作为一种蛋白质组学研究手段，通过在实验中引入内标来减少实验误差，并且可以通过直观的图谱观察可以分析相关蛋白质的翻译后修饰水平。
编辑: helen
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
