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质谱应用于蛋白磷酸化研究

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发布日期:2012-05-30 15:29 文章来源:丁香园
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关键词: 生物专题 蛋白 丁香园 丁香通 欧易 oebiotech   点击次数:


Proteomic Investigations Reveal a Role for RNA Processing Factor THRAP3 in the DNA Damage Response
Molecular Cell 46, 212-225, April 27, 2012 ?2012 Elsevier Inc.


Copenhagen大学的研究者用基于质谱的蛋白质组学phosphoproteome,acetylome和proteome研究DNA损伤反应(DDR)前后的蛋白质修饰和翻译后修饰变化。研究发现,DNA损伤反应中Phosphorylation-dependent信号通路的调节强于乙酰化的调节。磷酸化分析数据中,有些预想中的蛋白质,比如DNA-PK,ATM,ATR激酶等,但是大部分蛋白质并没有DNA-PK/ATM/ATR共有的motif,说明downstream kinases在放大DNA损伤信号中起到重要作用。作者发现RNA processing factors PPM1G,THRAP3是recruited to and excluded from sites of DNA damage。而且发现,THRAP3敲除导致细胞对DNA损伤物质敏感。上述研究表明,RNA代谢通路相关蛋白与DNA修复有关。



A: 基于SILAC的蛋白质定量分析(另一种常用的分析方法为基于iTraq的蛋白质定量分析),样品分为两组,一组为对照(轻标),另一组为DNA damage-inducing试剂处理(重标)。Phosphoproteome先用TiO2富集磷酸化肽,再经质谱分析,质谱结果由MaxQuant软件分析。Acetylome由乙酰化抗体富集乙酰化肽段,再由质谱分析。



B: DNA损伤反应前后磷酸化和乙酰化修饰变化,磷酸化肽段2倍以上的定量差异为Regulated,乙酰化肽段1.5倍以上的定量差异为Regulated。DNA损伤反应后Regulated位点分布在细胞核内的比分布在细胞核外的多。
C,D:DNA损伤反应前后包含S/TQ Motif和不包含S/TQ Motif的磷酸化修饰,发现non-S/TQ Motif的磷酸化修饰较多。


A:左图为作者用STRING分析DNA损伤后磷酸化修饰上调的蛋白质之间的联系。右图为作者用MCODE分析的相互联系的两个子通路。


B:磷酸化修饰上调的蛋白质,其中红色的为具有S/TQ motif蛋白质,未填充颜色的为non-S/TQ motif的蛋白质。

作者质谱研究发现,DDR(DNA damage response)与TNF-α/IL-1信号通路有crosstalk关联。TNF-α/IL-1信号通路中的一些蛋白,如TRAF2,p62,RIPK1,IKB-ε,CYLD在DDR中发生了磷酸化修饰的变化。作者发现CYLD在DNA 损伤诱导的NF-κB活性中起到negative regulatory的作用。



A:由左到右分别为细胞未处理,加入TNF-α,exposed to ionizing radiation(IR),加入etoposide(Etp)处理。抗体为Ser-418 phospho-specific CYLD antibody
B:不同时间exposed to ionizing radiation(IR)的western blot分析,抗体为Ser-418 phospho-specific CYLD antibody
C:CYLD抑制NF-κB亚基p65的转运活性
D,E:CYLD抑制DNA损伤诱导的NF-κB 转录活性,细胞转染了表达CYLD的质粒和空质粒,NF-κB 转录活性由luciferase-based reporter分析。

作者发现RNA processing factors PPM1G,THRAP3与DNA损伤修复有关联。作者选择Ser-61 BIO磷酸化抗体检测PPM1G磷酸化修饰水平,发现细胞由DNA损伤物质etoposide或者IR照射后PPM1G磷酸化修饰上调。Ser-61 BIO磷酸化抗体作用于PPM1G的Ser-183位而非Ser-201。之前也有研究表明,siRNA-mediated depletion PPM1G会显著降低细胞增殖能力,支持了PPM1G具有增强细胞抵御DNA损伤物质的能力。



A:左图为Ser-61磷酸化特异性Bid抗体Western Blot结果,右图为GFP抗体Western Blot结果。U2OS细胞分别转染了GFP,GFP-PPM1G质粒,Etp IR处理不同时间。
B:PPM1G和BIO序列比对,PPM1G序列SER-183与BIO序列SER-61一致。
C: 左图为GFP IP后的Western Blot结果,右图为全细胞裂解产物Western Blot结果
D:U2OS细胞转染GFP-PPM1G质粒后在不同时间微量照射示意图

作者发现,THRAP3在DNA损伤后磷酸化修饰上调,THRAP3所包含的一些蛋白SNIP1,PNN,BCLAF1,SKIIP等磷酸化水平同样上调,说明整个THRAP3复合物蛋白都和DNA损伤相关。作者发现,THRAP3磷酸化水平变化与ATR相关,在抑制ATR后,THRAP3磷酸化水平受到抑制,与同样受控于ATR的CHK1相似。THRAP3由siRNA沉默后细胞对DNA损伤物质HU敏感。



A,B:THRAP3的磷酸化western blot,细胞由etoposide,HU,4NQO,Ptase等处理
C:THRAP3的磷酸化western blot
D:THRAP3的磷酸化western blot,细胞由ATM,DNA-PK,ATR,WOR的抑制剂处理1小时,再由DNA损伤物质Etp处理。
E:siTHRAP3-1沉默掉THRAP3后细胞在HU处理后存活情况。
F:Hela -GFP-THRAP3细胞laser诱导DNA损伤后THRAP3 exclusion情况
G:Laser damage20分钟,1.5小时,20小时的THRAP3 exclusion情况
H:细胞由ATM,DNA-PK,ATR,WOR的抑制剂处理1小时,再微量照射的DNATHRAP3 exclusion情况
 

编辑: helen

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