质谱应用于蛋白磷酸化研究
Proteomic Investigations Reveal a Role for RNA Processing Factor THRAP3 in the DNA Damage Response
Molecular Cell 46, 212-225, April 27, 2012 ?2012 Elsevier Inc.
Copenhagen大学的研究者用基于质谱的蛋白质组学phosphoproteome，acetylome和proteome研究DNA损伤反应（DDR）前后的蛋白质修饰和翻译后修饰变化。研究发现，DNA损伤反应中Phosphorylation-dependent信号通路的调节强于乙酰化的调节。磷酸化分析数据中，有些预想中的蛋白质，比如DNA-PK，ATM，ATR激酶等，但是大部分蛋白质并没有DNA-PK/ATM/ATR共有的motif，说明downstream kinases在放大DNA损伤信号中起到重要作用。作者发现RNA processing factors PPM1G，THRAP3是recruited to and excluded from sites of DNA damage。而且发现，THRAP3敲除导致细胞对DNA损伤物质敏感。上述研究表明，RNA代谢通路相关蛋白与DNA修复有关。
A： 基于SILAC的蛋白质定量分析（另一种常用的分析方法为基于iTraq的蛋白质定量分析），样品分为两组，一组为对照（轻标），另一组为DNA damage-inducing试剂处理（重标）。Phosphoproteome先用TiO2富集磷酸化肽，再经质谱分析，质谱结果由MaxQuant软件分析。Acetylome由乙酰化抗体富集乙酰化肽段，再由质谱分析。
B： DNA损伤反应前后磷酸化和乙酰化修饰变化，磷酸化肽段2倍以上的定量差异为Regulated，乙酰化肽段1.5倍以上的定量差异为Regulated。DNA损伤反应后Regulated位点分布在细胞核内的比分布在细胞核外的多。
C，D：DNA损伤反应前后包含S/TQ Motif和不包含S/TQ Motif的磷酸化修饰，发现non-S/TQ Motif的磷酸化修饰较多。
A：左图为作者用STRING分析DNA损伤后磷酸化修饰上调的蛋白质之间的联系。右图为作者用MCODE分析的相互联系的两个子通路。
B：磷酸化修饰上调的蛋白质，其中红色的为具有S/TQ motif蛋白质，未填充颜色的为non-S/TQ motif的蛋白质。
作者质谱研究发现，DDR（DNA damage response）与TNF-α/IL-1信号通路有crosstalk关联。TNF-α/IL-1信号通路中的一些蛋白，如TRAF2，p62，RIPK1，IKB-ε，CYLD在DDR中发生了磷酸化修饰的变化。作者发现CYLD在DNA 损伤诱导的NF-κB活性中起到negative regulatory的作用。
A：由左到右分别为细胞未处理，加入TNF-α，exposed to ionizing radiation(IR)，加入etoposide（Etp）处理。抗体为Ser-418 phospho-specific CYLD antibody
B：不同时间exposed to ionizing radiation(IR)的western blot分析，抗体为Ser-418 phospho-specific CYLD antibody
C：CYLD抑制NF-κB亚基p65的转运活性
D，E：CYLD抑制DNA损伤诱导的NF-κB 转录活性，细胞转染了表达CYLD的质粒和空质粒，NF-κB 转录活性由luciferase-based reporter分析。
作者发现RNA processing factors PPM1G，THRAP3与DNA损伤修复有关联。作者选择Ser-61 BIO磷酸化抗体检测PPM1G磷酸化修饰水平，发现细胞由DNA损伤物质etoposide或者IR照射后PPM1G磷酸化修饰上调。Ser-61 BIO磷酸化抗体作用于PPM1G的Ser-183位而非Ser-201。之前也有研究表明，siRNA-mediated depletion PPM1G会显著降低细胞增殖能力，支持了PPM1G具有增强细胞抵御DNA损伤物质的能力。
A：左图为Ser-61磷酸化特异性Bid抗体Western Blot结果，右图为GFP抗体Western Blot结果。U2OS细胞分别转染了GFP，GFP-PPM1G质粒，Etp IR处理不同时间。
B：PPM1G和BIO序列比对，PPM1G序列SER-183与BIO序列SER-61一致。
C： 左图为GFP IP后的Western Blot结果，右图为全细胞裂解产物Western Blot结果
D：U2OS细胞转染GFP-PPM1G质粒后在不同时间微量照射示意图
作者发现，THRAP3在DNA损伤后磷酸化修饰上调，THRAP3所包含的一些蛋白SNIP1，PNN，BCLAF1，SKIIP等磷酸化水平同样上调，说明整个THRAP3复合物蛋白都和DNA损伤相关。作者发现，THRAP3磷酸化水平变化与ATR相关，在抑制ATR后，THRAP3磷酸化水平受到抑制，与同样受控于ATR的CHK1相似。THRAP3由siRNA沉默后细胞对DNA损伤物质HU敏感。
A，B：THRAP3的磷酸化western blot，细胞由etoposide，HU,4NQO,Ptase等处理
C：THRAP3的磷酸化western blot
D：THRAP3的磷酸化western blot，细胞由ATM，DNA-PK，ATR，WOR的抑制剂处理1小时，再由DNA损伤物质Etp处理。
E：siTHRAP3-1沉默掉THRAP3后细胞在HU处理后存活情况。
F：Hela -GFP-THRAP3细胞laser诱导DNA损伤后THRAP3 exclusion情况
G：Laser damage20分钟，1.5小时，20小时的THRAP3 exclusion情况
H：细胞由ATM，DNA-PK，ATR，WOR的抑制剂处理1小时，再微量照射的DNATHRAP3 exclusion情况
编辑: helen
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