抗体芯片技术应用于肿瘤侵袭机制研究
抗体芯片技术应用于肿瘤侵袭机制研究（Journal of Clinical Investigation 2010）
Emory大学的研究者通过前期实验筛选到RSK2蛋白，认为RSK2与头颈部鳞状细胞癌转移相关。研究者首先使用头颈部鳞状细胞癌细胞系、临床标本进行了RSK2表达水平的检测，继而进行了RSK2活性抑制实验，RNAi实验，以及stable knock down实验证明了RSK2与肿瘤细胞的转移相关，在此基础上，研究者将RSK2 knock out的头颈部鳞状细胞癌细胞系接种到裸鼠体内，观察到敲除后的细胞系不影响肿瘤形成，但是影响了肿瘤的转移。
A：高转移能力细胞系M4e RSK2 stable knock down；B：淋巴结vimentin免疫组化检测；
C： RSK2敲除后肿瘤形成未受影响；D：肿瘤Ki－67免疫组化检测。
那么RSK2影响肿瘤转移的机制是什么呢？Western Blot检测发现与转移相关的Erk、Akt、Stat3都没有变化，那么其他激酶呢？
A：M4e细胞RSK2敲除前后Erk、Akt、Stat3磷酸化水平没有变化；
B： MAPK 信号通路以及RSK2在信号通路中的位置
根据已有的研究，RSK2与MAPK通路密切相关，因此研究者选择了MAPK pathway的磷酸化水平检测芯片（包括185种抗体，约90个磷酸化位点），对RSK2敲除前后的M4e细胞进行了检测，以磷酸化水平变化15％为标准，筛选到C-MET、FAK、C-JUN、CREB、HSP27等蛋白质磷酸化水平下调。
其中C-MET与FAK处在通路图的上游，而且是酪氨酸激酶，而RSK2是丝氨酸苏氨酸激酶，WB的结果验证了芯片结果是可靠的，作者分析，这两个蛋白的磷酸化之所以发生改变，应该是RSK2敲除后，肿瘤细胞的转移前信号通路重新响应的结果；
而对于CREB蛋白，已知RSK2可以调节与激活CREB蛋白，作者在不同细胞系中又进行了CREB敲除、RSK2过表达与CREB敲除、野生型以及突变型CREB过表达实验，发现CREB的侵袭能力依靠RSK2表达与激活ser133磷酸化；
研究者发现的另一个非常值得关注的成员是HSP27蛋白，它有可能是RSK2的一种新的底物。为了探索RSK2与HSP27的关系，进行了体外测定实验，在野生型、S15、S78、S82突变型的HSP28中分别加入RSK2，实验发现RSK2可以磷酸化野生型的S78、S82位点，而不影响S15位点。这说明HSP27是RSK2的一种新的磷酸化底物；
作者进而进行了一系列转染、突变等试验，证实HSP27的侵袭能力需要RSK27激活S78、S82磷酸化；
A：RNAi Hsp27显著影响细胞的侵袭能力；
B：只有稳定转染Hsp27 S78与S82双磷酸化突变的细胞侵袭能力显著提高。
同时，作者直接观察了HSP27与肌动蛋白关系。发现RSK2敲除后，肌动蛋白无法维持其结构，当转染S78、S82磷酸化双突变的HSP27后，肌动蛋白的结构获得稳定；
以上说明RSK2通过调节HSP27磷酸化来维持肌动蛋白的稳定性。
讨论中，作者对抗体芯片的应用特别指出，抗体芯片是一种高通量的手段，磷酸化与非磷酸化抗体的配对对实验数据的处理带来了便利，芯片的应用不仅可以鉴定出潜在的底物，还可以发现新的相互作用，例如C-MET和RSK2；最后一点，芯片提供了一种发现与要研究的蛋白相关的新的信号通路以及全面理解其作用机制的手段。
编辑: helen
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