基因操作工具-慢病毒
病毒滴度的测定
稀释计数法
滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天 细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天 加病毒
在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。
第三天 追加培养液
在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天 观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法
病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI (Takara Mirus Bio，终浓度为10 U/ml)的新鲜培养基。在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：
| 2× TaqMan Master Mix | 25 μl × n |
| Forward primer (100 pmol ml-1) | 0.1μl × n |
| Reverse primer (100 pmol ml-1) | 0.1μl × n |
| Probe (100 pmol ml-1) | 0.1μl × n |
| H2O | 19.7μl × n |
n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：
| 2× TaqMan Master Mix | 25 μl × n |
| 10×RNaseP primer/probe mix | 2.5 μl × n |
| H2O | 17.5μl × n |
n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震荡后放在冰上。
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）。
分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）。
所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统。循环条件设定为： 50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，然后是95℃ 15秒，60℃ 1分钟的40个循环。
数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：
IU ml-1 = (C ×N× D×1000)/V
其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数
N = 感染时细胞的数目（约为1×105）
D = 病毒载体的稀释倍数
V = 加入的稀释病毒的体积数
慢病毒的储存与稀释
慢病毒的储存
1. 病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于一周内用完）。
2. 若病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃约12个月以上，但若超过6个月后使用，请重新检测病毒滴度。
3. 避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度10%。
慢病毒的稀释
需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank's、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（于一周内用完）。
慢病毒在细胞水平的使用
什么是MOI？
“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）。在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。
MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体（in vivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。
目的细胞感染预实验及实验体系的放大
实验目的：确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene。
实验材料：96孔板，1.5ml EP管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目的细胞培养基等。
第一天：细胞准备
将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3×104~5×104个/ml，按90μl/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间。
第二天：病毒感染
感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybrene。病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1（细胞经过一天的生长数量约为1×104个/孔，对应的病毒数量为1×106TU、1×105TU和1×104TU）。每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为1：2000，终浓度为5μg/ml。
第二天：换液
感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔。
第五天：观察荧光表达情况
在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene。
对于因目的基因较大，载体无法携带标志基因的，可以通过定量PCR来检测目的基因的表达来评估感染效率。
实验体系的放大
正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大。放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度较大，可进行对MOI的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。
表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值
| 单孔底面积（cm2） | 正常培养体积（μl） | 感染时体积（μl） | MOI=1 病毒量（TU） | MOI=10 病毒量（TU） | MOI=100病毒量（TU | |
| 96孔板 | 0.3 | 100 | 100 | 1×104 | 1×104 | 1×104 |
| 48孔板 | 0.6 | 200 | 200 | 2×104 | 2×105 | 2×106 |
| 24孔板 | 1.9 | 500 | 500 | 6×104 | 6×105 | 6×106 |
| 12孔板 | 3.8 | 1000 | 500 | 2×105 | 6×106 | 6×107 |
| 6孔板 | 9.5 | 2000 | 1000 | 2×105 | 2×106 | 2×107 |
| T25瓶 | 25 | 5000 | 2500 | 5×105 | 5×106 | 5×107 |
*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。
*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
编辑: cq
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