基因操作工具-慢病毒
慢病毒在整体动物水平的使用
到目前为止，慢病毒已经广泛应用于大鼠，小鼠，兔，猪和鸡等动物的局部注射和基因治疗等领域，所采用的方法包括皮下注射，尾静脉注射和核团注射等，也可以先对原代细胞或者细胞系进行基因操作之后再回输体内进行治疗实验，一般流程如下图所示：
由于慢病毒在整体动物实验的复杂性和多样性，请直接将您的问题和建议与我们的动物工程师讨论，上海生博动物中心的慢病毒技术工程师也愿意与您分享他们在这一领域的经验，联系电话021-50793722-604电子邮sunbio_techservice@sbo-bio.com.cn
SunBio三套病毒载体比较
| 病毒表达系统 | 腺病毒表达系统（Adenovirus） | Lentivirus表达系统（Lentivirus） | 腺相关病毒表达系统 （AAV） |
| 病毒基因组 | 双链DNA病毒36Kb | RNA病毒 | 单链DNA病毒 4. 7～6 kb |
| 复制 | 自主复制 | 自主复制 | 依赖于辅助病毒 如腺病毒和疱疹病毒 |
| 是否整合 | 病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因 | 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因 | 在缺少辅助病毒的情况下，腺相关病毒整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合可长期稳定表达 |
| 感染细胞类型 | 感染分裂和不分裂细胞 | 感染分裂和不分裂细胞 | 感染分裂和不分裂细胞 特别是能够感染神经元和神经胶质细胞 |
| 表达丰度 | 高水平表达 | 中水平表达 | 中水平表达 |
| 表达时间 | 快（1-2天） | 慢(2-4天) | 快（2-3天） |
| 滴度 | 滴度高达1012 pfu/ml | 滴度最高可达 108 TU/ml | 滴度最高可达 1012 TU/ml |
| 克隆容量 | 可插入高达8 kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 | 可插入不超过8 kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 | 可插入不超过5 kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 |
| 免疫原性 | 高免疫原性 | 低免疫原性 | 低免疫原性 |
| 包装方法 | A. 一个腺病毒基因组质粒如pJM17和一个腺病毒载体穿梭质粒如pAD5CMV共转染293细胞利用这两个质粒的腺病毒同源序列在细胞中重组获得重组腺病毒。 B. Ad-Easy原理是通过同源臂重组的方式在细菌中获得重组腺病毒基因组质粒。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的质粒共转化RecA+细菌，在细菌RecA重组酶的作用下经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其线性化后转染293细胞获得重组病毒。 C. AdMax包装系统：通过Cre/loxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。 | A. 第一代慢病毒将HIV-1基因组中进行包装、逆转绿和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个独立的质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒，用这三种质粒共同转染包装细胞如人胚肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。 B. 第二代慢病毒载体系统从安全性角度又删去了HIV的所有附属基因。 C. 第三代慢病毒载体又进一步做了些安全方面的改进，如删除了U3区的3′LTR和tat基因。 | A. 共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中实现病毒包装。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成有复制能力的AAV B. 使用辅助质粒包装病毒。优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出 |
| 纯化方法 | A.CsCl或蔗糖密度梯度离心；B. 腺病毒纯化试剂盒等阴离子柱层析 | A.超速离心B.PEG-8000沉淀 | A.加热失活法和平衡密度梯度离心法；B. 亲和层析法纯化 |
| 应用领域 | a. 癌症基因治疗 b. 遗传疾病 c. 其他疾病治疗 d. 其他用途 | a. 艾滋病治疗； b. 神经系统疾病的基因治疗； c. 血液系统疾病的基因治疗； d. 囊性纤维化和色素性视网膜炎 | a. In vivo 基因治疗； b. Ex vivo基因治疗； c. 遗传病基因治疗； d. 获得性慢性疾病的基因治疗。 |
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编辑: cq
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