基因操作工具-腺相关病毒
感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。病毒互补链的合成依赖于细胞复制因子。这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。通常，为了基因的稳定表达，AAV基因组在细胞内会形成高分子量多联体。
图1 重组AAV颗粒的生产
载体特征
pAAV-MCS和pAAV-IRES-hrGFP(目录号 #240075,)载体包含CMV启动子和当外源基因克隆进多克隆位点（MCS）时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件。这两个载体同时也包含指导病毒复制和包装的AAV-2反向末端重复序列（ITRs）。
除去这些共有的特征，pAAV-IRES-hrGFP载体还包含一个新型海生生物来源的人源化重组绿色荧光蛋白（humanized recombinant green fluorescent protein, hrGFP），作为翻译自脑心肌炎病毒（encephalomyocarditisvirus, EMCV）内核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）的第二个读码框进行表达。利用pAAV-IRES-hrGFP表达外源基因一个重要的好处是，hrGFP荧光可以用来直接测定重组病毒溶液的滴度。另外，既然两种蛋白质翻译自一个转录本，hrGFP的表达可以用来判断靶细胞的感染效率，也可以充当插入的外源基因的表达标志。pAAV-IRES-hrGFP在MCS的C-端有一个3× FLAG®。克隆的外源基因结构内带有的标签可以用抗-FLAG抗体进行检测或纯化。当转基因编码的蛋白质抗体无法获得时，这个特征就会很有用。由于AAV-2包装大小参数的原因，这些载体的可插入外源基因的大小是受到限制的。较少标记的pAAV-MCS载体推荐插入大小接近3kb，而pAAV-IRES-hrGFP只能容许插入≤1.7 kb。
注：当外源基因克隆进pAAV-IRES-hrGFP时，重组病毒溶液的滴度可以直接测定。然而由于IRES序列位于hrGFP可读框的前面，导致报告基因表达处于相对较低的水平。和重组pAAV-hrGFP-AAV病毒滴度相比，我们测定的pAAV-IRES-hrGFP-AAV的病毒滴度要低10倍。
当不能插入包含ITR的载体时，pCMV-MCS可以作为穿梭载体使用。这个载体提供CMV启动子和其它哺乳动物细胞高水平基因表达元件，但是缺少ITR序列。表达盒侧翼的Not I限制位点由于亚克隆包含外源基因的表达盒到包含ITR的载体中。任何包含ITR的pAAV载体（pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP, pAAV-LacZ或 pAAV-hrGFP）都可以用做接受亚克隆的载体。
pAAV-MCS和pAAV-IRES-hrGFP载体包含CMV启动子和当外源基因克隆进多克隆位点时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件。这两个载体同时也包含指导病毒复制和包装的AAV-2反向末端重复序列（ITRs）。
pAAV-LacZ和pAAV-hrGFP但当AAV-293包装病毒时监测转染效率的报告质粒，检测病毒产品的控制点和用作直接测定重组病毒滴度。在这些控制载体中，序列顺序依次为CMV启动子，LacZ或hrGFP表达盒，然是是ITR序列。pAAV-hrGFP可以用作生产细胞系转染效率的质量评估和荧光显微镜和流式细胞仪（fluorescence activated cell sorting, FACS）监测病毒滴度。
pAAV-RC质粒包含AAV-2的依次编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因。稳固rep和cap基因的表达水平是获得期望的高滴度病毒产品的关键步骤。pAAV-RC利用两个不同的启动子分别控制Rep和Cap的表达，以获得每套基因产品的最佳表达水平。
pHelper质粒包含AAV-293生产高滴度病毒必须的腺病毒基因VA，E2A和E4的集合。AAV-2生产所必需的腺病毒蛋白质E1A和E1B在AAV-293细胞中稳定表达。
AAV-293细胞培养指南
AAV-293细胞说明
我们建议利用AAV-293细胞系来生产腺相关重组病毒溶液。AAV-293细胞衍生自通常使用HEK293细胞系，但是能生产出高滴度的病毒。HEK293细胞是用剪切过的5型腺病毒DNA改变过的人胚肾细胞。和HEK293一样，AAV-293也生产反式E1，这样当细胞用删除E1的腺病毒载体转染或用AAV Helper-Free System三质粒（包含ITR质粒，pAAV-RC和pHelper）共转时能生产出具有感染能力的病毒颗粒。
注：使用AAV Helper-Free System，利用AAV-293细胞生产病毒颗粒是必须的。既然重组AAV-2载体需要衍生自HEK293的AAV-293细胞稳定表达腺病毒E1基因产物，那么利用其它细胞替代将不能凑效。所有步骤必须在层流净化罩无菌条件下完成。AAV-293细胞在组织培养盘中贴壁不佳，并具有成团趋势。换液时，吸液管靠在培养皿的边上轻轻地加入而不要直接加到细胞上，避免细胞单层的破裂。为了确保溶液的完整性，维持高滴度生产表型维持AAV-293细胞≤ 50%的汇合率是非常重要的。
冻存AAV-293细胞的复苏培养
1. 将10mlDMEM生长培养基（见培养基和试剂的准备）加入15ml圆锥管中。
2. 将细胞冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动1-2分钟使之融解。从水浴中拿出冻存管并通过用70%酒精（室温）擦拭管表面进行净化。
3. 将融解的细胞悬浮液移至装有10 ml生长培养基的锥形管中。
4. 200×g，3分钟，室温离心收集细胞。吸去生长培养基。
5. 加入5 ml新鲜生长培养基到锥形管中，用吸液管上下轻轻吹打使细胞悬浮。
6. 将5 ml细胞悬浮液移至75cm2含有10 ml新鲜生长培养基的组织培养瓶中。将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。
7. 每天监视细胞密度。当细胞培养至50%汇合率时要进行传代。接下来进行AAV-293细胞传代或AAV-293细胞液氮存贮液的准备。
编辑: cq
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