基因操作工具-腺相关病毒
AAV-293细胞的传代
注：下述的实验方案是从75cm2组织培养瓶中传代细胞。
当细胞单层达到50%汇合率时需要进行传代，如果细胞汇合率超过70%，AAV-293细胞会失去增强的病毒生产表型。
1. 在37℃水浴中预热DMEM生长培养基和胰酶-EDTA溶液。
2. 移去生长培养基。用10 mlPBS(phosphate-buffered saline)清洗细胞一次。
3. 用5 ml胰酶-EDTA溶液消化细胞1-3分钟。
注： 用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。
4. 用5 ml生长培养基稀释细胞以使胰酶失活。
5. 分别转移2 ml的细胞悬浮液到每一个175cm2的组织培养瓶，共5瓶。每一瓶含有28 ml的生长培养基。将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。每天查看细胞密度，细胞汇合率要维持在50%。
§见培养基和试剂的准备。
AAV-293细胞液氮冻存
1． 37℃水浴预热DMEM生长培养基，胰酶-EDTA溶液和冻存培养基。
2． 收集健康的处于对数生长期的细胞。吸去生长培养基，用10 ml PBS清洗细胞。用胰酶-EDTA溶液作用于细胞1-3分钟。
注： 用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。
3． 用10ml生长培养基稀释细胞阻止胰酶作用。转移细胞悬液到50ml离心管中。取一小份细胞用血细胞计数器计数。
4． 200 × g，10分钟，室温离心收集细胞。吸除生长培养基。
5． 用冻存培养基（见培养基和试剂的准备，不含抗生素）再悬浮细胞至1×106个/ml，然后分装细胞悬液到2ml冷冻管，1 ml/管。
6． 通过逐渐降温冷冻细胞。将小管至于泡沫盒然后将盒子放入-80℃冷冻过夜。
7． 转移冻存细胞的小管到液氮中长期保存。
初级AAV溶液的制备
准备AAV-293细胞
在每一个100-mm组织培养盘10 mlDMEM生长培养基中加入3×106 个AAV-293细胞，48小时后用于转染。
注：为了获得较高的滴度，AAV-293细胞的健康和传代的密度是非常重要的因素。当细胞汇合率达到50%时须传代。当细胞在低代并生长健康是进行大量冻存是非常重要的。当传代和铺板用于转染时要避免细胞成团。在用AAV质粒转染之前细胞或许会生长到较高的汇合率。
AAV-293细胞的转染
尽管大量的转染实验方案可以成功用于这些载体的转染，但是推荐使用磷酸钙转染方法。本实验方案用于转染AAV-293细胞时，可稳定获得>107病毒颗粒/毫升的产品滴度。进一步获得高滴度AAV病毒的实验方法，属于保密资料，暂时不提供
编辑: cq
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