点击量上万的细胞培养资料

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发布日期：2012-02-16 16:51 文章来源：丁香园
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

4、连续式培养的特点： 细胞维持持续指数增长； 产物体积不断增长； 可控制衰退期与下降期。 五、灌流式培养（perfusion culture）

1、灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。

灌流式培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。

中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

另外一种形式是固定床或流化床生物反应器，固定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。

2、灌流式培养的优点： 细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达10⁷-10⁹/ml，从而较大的提高了产品的产量； 连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低； 反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高； 产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。 连续灌注培养是近年用于动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种方式。应用连续灌流工艺的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。这种方法最大困难是污染机率较高，长期培养中细胞分泌产品的稳定性，规模放大过程中工程问题。

六、细胞工厂培养 细胞工厂(cell factory)是一种设计精巧的细胞培养装置。它在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间,并可节省贵重的培养液。更重要的是，它可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失。它是对传统转瓶培养的革命。

丹麦NUNC公司生产的NUNC细胞工厂是目前应用较多的细胞工厂系统。可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，可提供1，2，10和40盘的规格使放大变得简单易行，低污染风险，节省空间，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生长。同时，与NUNC的细胞工厂操作仪结合使用，可全面实现细胞培养的自动化，从而大大地减低劳动强度和密集度。

这套系统使用很方便，可产生类似塑料培养瓶的效果。由组织培养级聚笨乙烯制成，使用后可随意处理。其最大缺点是：经胰酶消化后，很难将细胞完全洗出。

第四节 动物细胞大规模培养用生物反应器简介

动物细胞培养技术能否大规模工业化、商业化，关键在于能否设计出合适的生物反应器（bioreactor）。由于动物细胞与微生物细胞有很大差异，传统的微生物反应器显然不适用于动物细胞的大规模培养。首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物的合成。

一、生物反应器分类

目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。

按其培养细胞的方式不同，这些反应可分为以下三类：

1、悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、气升式反应器；

2、贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器；

3、包埋培养用反应器：如流化床反应器、固化床反应器。

二、搅拌罐生长反应器 这是最经典、最早被采用的一种生物反应器。此类反应器与传统的微生物生物反应器类似，真对动物细胞培养的特点，采用了不同的搅拌器及通气方式。通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布，使养分充分被细胞利用，并增大气液接触面，有利于氧的传递。现已开发的有：笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式搅拌器、海般式搅拌器等。

三、气升式生物反应器

1979年首次应用气升式生物反应器成功的进行了动物细胞的悬浮培养。气升式生物反应器的话优点：

罐内液体流动温和均匀，产生剪切力小，对细胞损伤较小；

可直接喷射空气供氧，因而氧传递率较高；

液体循环量大，细胞和养分都能均匀分布于培养液中；

结构简单，利于密封并降低了造价。

常用的气升式反应器有三种：内循环式气升式、外循环式气升式、内外循环式气升式生物反应器。

四、鼓泡式生物反应器

与气升式反应器相类似，是利用气体鼓泡来进行供氧及混合，其设计原理与气升式生物反应器也相同。

五、中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。

优点是：

占地空间少；

细胞产量高，细胞密度可达10⁹数量级；

生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

六、生物反应器的设计和放大 设计的总体考虑是：

①结构严密，能耐受蒸汽灭菌，采用对生物催化剂无害和耐蚀材料制作，内壁光滑无死角，内部附件尽量减少，以维持纯种培养需要；

②有良好的气-液接触和液-固混和性能和热量交换性能，使质量与热量传递有效地进行；

③保证产物质量和产量前提下，尽量节省能源消耗；

④减少泡沫产生，或附有消沫装置以提高装料系数，并有必要可靠的参数检测和控制仪表并能与计算机联机。

生物反应器的放大一种新的生物技术产品从实验室到工业生产的开发过程中，会遇到生物反应器的逐级放大问题，每一级约放大10～100倍。生物反应器的放大，表面看来仅是一个体积或尺度放大问题，实际上并不是那么简单。

反应器放大研究虽已提出了不少方法，但还没有一种是普遍都能适用的。目前还只能是半理论半经验的，即抓住反应过程中的少量关键性参数或现象进行放大。

有关氧传递问题在生物反应器中，氧的传递速率要满足细胞对氧的摄取速率，并使反应器中溶解氧的浓度CL要维持在一定水平上。这就是说，在稳态情况下，供氧与需氧间存在下列关系：KLa(C*-CL)=r

此处， KLa为氧的传递系数；C*为相当气相氧分压的溶氧浓度，CL为培养液中溶氧浓度，r为摄氧率。

影响供氧的因素从上式可知r=KLa(C*-CL)；因此影响供氧的因素总体上讲是KLa和C*-CL值。

要增大C*-CL，无非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有适当增加反应器中操作压力和增大气相中的氧分压两个方法。在实际操作中，反应器保持一定正压，以防止大气中的杂菌从轴封、阀门等处侵入，但在增加罐压的同时，发酵代谢所产生的CO₂也会更多地溶解于培养液而对发酵不利。至于CL值，一般不允许过分减小，因为细胞在生长中有一个临界氧浓度，低于此临界值，细胞的呼吸将受到抑制。

影响KLa的因素大致可分为三个方面：一是反应器的结构，包括相对几何尺寸的比例；二是操作条件，如搅拌功率或循环泵功率的输入量，通气量等；三是培养或发酵液的物理化学性质，如流变特性，特别是其粘度或显示粘度、表面张力、扩散系数、细胞形态、泡沫程度等。

生物反应器中的传热在细胞培养和发酵过程中，热量的释放是普遍存在的。这是因为在培养或发酵过程中细胞与周围环境的物质产生新陈代谢，即发生异化（分解）作用和同化（合成）作用，而异化作用一般释放能量，同化作用则是吸收能量。同化作用包括细胞生长、繁殖、产物形成所需能量来自细胞对培养基中的基质及营养成分的异化。从热力学角度讲，异化所产生能量必然应多于同化所需要能量，而多余的能量则转化为热能释放到周围环境中去。无论是涉及细胞或酶的反应中，释放出的热量都应及时移去，以免影响过程的正常进行，为此在生物反应器中一般都附有冷却装置。

第五节 微载体培养技术（microcarrier culture technique）

一、微载体培养应用 此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。

使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。

编辑: cq

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