点击量上万的细胞培养资料

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发布日期：2012-02-16 16:51 文章来源：丁香园
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

3、细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象，常见的细胞死亡形式有3种：坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中，因为环境因素的突然变化或病原物的入侵，导致一部分细胞死去，称为细胞的病理死亡，或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡；细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于其它两种细胞死亡机理，如杀伤T细胞的细胞毒性作用。

还有一种情况，一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动（代谢、生长、发育、分化）的一个必要部分；似乎带有“牺牲局部，保全整体”的意味。这种情况下的细胞死亡，明显地受遗传控制，称为细胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）则是程序性的、正常的细胞死亡，是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程，无论从形态学、生物学还是生化的特征来说，都有明显的区别。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果将是可怕的：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征（HIV）、重症肝炎与退行性神经疾病，如老年性痴呆症（Alzheimer's disease）、帕金森氏症（Parkinson's disease）。因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。

细胞凋亡与坏死的区别

坏死 ：

形态学特征-膜完整性丧失，胞浆和线粒体膨胀，全细胞裂解。

生化特征-离子内环境失调：非能量依赖性的（被动过程，在4°C也可以发生），随机消化DNA（电泳显示为DNA弥散状态），Postlytic DNA断裂。

生理学特征-影响群组细胞：由非生理学因素引起（如补体攻击、代谢中毒、缺氧等），被巨噬细胞吞噬，周围有明显的炎症反应。

凋亡 ：

形态学特征-胞膜出芽，但保持完整，染色体聚集在核膜周边，胞浆收缩、细胞核凝集，最后细胞分裂为凋亡小体，Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加。

生化特征--ATP依赖性的（主动过程，在4°C不能发生），以核小体为单位剪切DNA（电泳显示为DNA ladder），Prelytic DNA 断裂,线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素c、AIF），Caspases级联活化，膜对称性改变（PS外翻）

生理学特征--只影响单个细胞，由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境改变等），被临近细胞和巨噬细胞吞噬，无炎症反应。

第四节 细胞计数及活力测定

一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）

2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇

3、材料：细胞悬液

三、操作步骤

（一）细胞计数

1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

（三）MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。

2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。

3、37℃下保温2小时。

4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。

5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

第五节 细胞的分裂指数

一、原理：体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品：CO₂培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管

2、试剂：培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液

三、操作步骤

1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

2、CO₂培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

3、取出盖片，按下列顺序操作：

PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

5、计算:

分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

四、注意事项;操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。

第六节 细胞周期的测定

一、原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器、用品：同常规细胞培养

2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

编辑: cq

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