各类细胞培养小结

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发布日期：2012-02-17 17:34 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 　 点击次数：

消化法原代培养兔胸主动脉平滑肌细胞

用DMEM配0.2%的1型胶原酶（用20的血清的DMEM配可能更好，有类似文献），分装于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1瓶消化液中消化，消化约10几个小时（消化程度的把握要体会），离心后，接种（若见细胞量大，成功把握大），绝对静置3天（没必要看，看多了无益），8天可传代。

犬胸主动脉平滑肌贴块法——方法成熟，比消化法好控制的多。

1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，不然先天不足；

2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪；

3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm²培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻；

4、贴块无内膜外膜面之分，亦无需刮除内膜，若内膜面向下，会有少量内皮细胞爬出组织块，但只要平滑肌细胞一旦爬出来，内皮细胞生长自然不占优势，会因为平滑肌细胞大量爬出、增殖而漂起来，换液可洗掉，另外传代可纯化平滑肌细胞。

5、培液Gibco的DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。

建议用1次性培养瓶，成功机会大于玻璃瓶。成功后再小心过度成玻璃瓶。块愈小愈好。用新刀，快，损伤小。全过程越短越好。组织块的边缘不齐整也不是什么很关键的问题，最重要的是组织块要尽量小，尽量能剪成小米粒大小；另外就是组织块要贴牢，其关键就是培养液可以在6小时后翻瓶的时间再加，这样就可以避免组织块贴不牢而悬浮起来的尴尬了。

人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察

1.标本采集　在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带， 挤出脐带血管中的血液，放入装有含青链霉素的PBS液瓶中，2h之内行脐静脉内皮细胞培养。

双抗：青霉素100u/ml；链霉素100μl/ml

PBS：KCl 0.2 g/L，KH₂PO4 0.24 g/L，NaCl 8.0g/L，Na₂ HPO4-7H₂ O 1.56g/L或Na₂ HPO₄ 1.44 g/L。 在800ml蒸馏水中加入上述质量物质，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。

2.原代血管内皮细胞的获取与培养　按Jaffe等人〔1〕的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃ PBS，冲洗两次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50ml锥形离心管中，加入小牛血清2ml终止酶反应。再以30ml PBS冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000r/min离心10min，弃上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)]培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×10⁵/ml接种至24孔培养板中，每孔1ml。置于5%CO₂ ，37℃静止培养24h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2d换液1次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。

胰蛋白酶溶液（100ml）配制：

1）将D-Hanks（橙红色）液高压消毒灭菌，用NaHCO3液调节pH至7.2左右。

2）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。

3）次日先用滤纸粗虑，再过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱或－20℃保存备用，常用浓度为0.25%或0.125%；胰蛋白酶溶液（深红色）偏酸，使用前用NaHCO₃调pH至7.2左右。

D－Hanks液配制：KCl 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.06 g/L ，NaCl 8.0g/L，NaHCO₃ 0.35 g/L，Na₂HPO₄-7H₂O 0.06g/L，酚红0.02 g/L

3．传代内皮细胞的培养　原代内皮细胞融合后用培养液冲洗两次，然后用0.25%胰酶加入到内皮细胞中，每孔0.3ml。边消化边在倒置显微镜下观察。细胞皱缩、彼此分离或呈大片状分离即可终止消化。加入含有10%小牛血清的培养液，吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按10⁵/ 个细胞/ml，继续培养。

4．血管内皮细胞的鉴定

1）倒置显微镜观察细胞的形态特点。

2）VWF相关抗原免疫荧光检查：在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，每孔中种植1ml含有10⁵个细胞的原代或传代内皮细胞悬液。待内皮细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，投入冷丙酮中(-18～-20℃)，细胞面向上，作用7min，用PBS冲洗3次，每次1min，而后进行间接免疫荧光检查，第一抗体为鼠抗人VWF单克隆抗体(苏州医学院血栓室提供)，1∶20倍稀释，加入50μl于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时不加一抗做阴性对照。用PBS冲洗3次后，加入异硫氢酸标记的二抗50μl(异硫氰酸标记羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗涤3次。然后立即在荧光显微镜下观察，摄片。 血管内皮细胞鉴定结果：　VWF相关抗原间接免疫荧光检查，原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。

5．内皮细胞体外生长情况　 用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞，接种在24孔塑料培养板各孔内4h后，大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状，少数细胞伸展，48～72h生长最快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有旋祸状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。于3～4d后融合，7～10d胞体呈多角形，相互嵌合，为单层呈铺路石状排列。

人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验（刘　金）

血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，在免疫调节，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养是体外研究内皮细胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了内皮细胞分离及体外培养的方法。人脐带静脉是人血管内皮细胞最易获取的来源，在人内皮细胞的研究中被普遍采用。

㈠ 原理

在体外，内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖，并可传代，可作为内皮细胞增殖，细胞因子分泌、表型等研究的模型。

㈡ 方法

1. 脐带内皮细胞的分离

试剂与器材

（1）胶原酶(Sigma)：I型((C-0130),用无血清RPMI 1640配成0.1%(W/V),分装、-20℃保存。

0.1％明胶：称取明胶，用三蒸水配成0.2％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，过滤，放4℃备用。(即用过滤法消毒)

（2）Cord Buffor

肝星状细胞培养

材料

相差显微镜，荧光显微镜，手术器械，雄性SD大鼠，体重250-450 g，戊巴比妥钠，200目尼龙网，小牛血清（或胎牛血清，则更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D-Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH₂PO₄ 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO₃ 0.35 g/L，Na₂HPO₄-7H₂O 0.06 g/L或Na₂HPO₄ 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L），HBSS，台盼兰等。

方法

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->门静脉插管-->D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉-->灌以胰酶消化液-->离体肝脏并剪碎-->继续消化-->以尼龙网过滤-->450 g X 5'（4度，下同）-->ppt以HBSS重悬-->混以Nycodenz液-->转至离心管，并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面细胞-->重悬、离心收集细胞-->细胞计数，并判断存活率和产量-->按照常规接种-->次日换液。

传代方法：弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->镜下观察细胞突起回缩（2-5分钟左右）-->以完全培液（DMEM+10% NBS）终止反应（若不用EDTA，可以不需离心）-->吹打，1:2-1:3接种，然后继续培养（5% CO₂，37度）。

结果

次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。

讨论

进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin和alpha-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！

参考文献

袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报 1996;23(2):90-93。

编辑: cq

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