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真核重组让研究更有价值
● 真核细胞本身的蛋白,尽量用真核表达,真核的表达环境使蛋白更有可能形成正确的结构,具备糖基化等修饰,更可能具有天然功能。而目前生命科学研究中,研究的模式生物大都为真核生物。
● 在真核细胞表达真核细胞的蛋白,折叠、修饰等方面更接近于天然蛋白,一般内毒素更低。这样试验过程才更接近真实的细胞活动。
● 如果你的运气足够好,发现你的实验结果可以为药物开发提供线索。恭喜你!如果你的实验是用真核表达的重组蛋白完成的,药企肯定会更感兴趣,因为这样的药物候选分子商业化风险更小。
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支原体污染的特点及检验
结果判读:
若有支原体污染,在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致,与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点,表示测试样品有支原体的污染。
Positive Result 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点,表示测试样品有支原体的污染。
污染测试--支原体 :
PCR方法原理:
利用具特殊专一性之primers,经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列,由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同,因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
特点:灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组,避免可能之污染。
缺点︰PCR反应很灵敏,易有伪阳性结果。此方法尚在评估中,故结果仅作为参考和内部品管之一部份。
材料与设备:
ATCC mycoplasma detection kit:可作50~100 reactions.
提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :
Taq polymerase ( 5 U / ul )
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment:
PCR thermal cycler
agarose电泳设备
DNA电泳胶体观察设备
无菌PCR反应管
无菌1.5 ml微量离心管
无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法:
此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果:使用UV light观察,并照相记录。
方法:
此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果:使用UV light观察,并照相记录。
编辑: cq