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真核重组让研究更有价值

● 真核细胞本身的蛋白，尽量用真核表达，真核的表达环境使蛋白更有可能形成正确的结构，具备糖基化等修饰，更可能具有天然功能。而目前生命科学研究中，研究的模式生物大都为真核生物。


● 在真核细胞表达真核细胞的蛋白，折叠、修饰等方面更接近于天然蛋白，一般内毒素更低。这样试验过程才更接近真实的细胞活动。


● 如果你的运气足够好，发现你的实验结果可以为药物开发提供线索。恭喜你！如果你的实验是用真核表达的重组蛋白完成的，药企肯定会更感兴趣，因为这样的药物候选分子商业化风险更小。

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细胞培养技术扫盲

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发布日期：2012-03-05 18:33 文章来源：丁香园
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关键词： 细胞培养 生物专题 丁香园 义翘神州 　 点击次数：

七、绒毛染色体制备

绒毛来源于胚胎的中胚层，最早的初级干绒毛出现于孕三周初，孕8周左右是绒毛发育最旺盛时期。目前国内外绒毛取材多选于8-9周。研究资料表明，绒毛取样不影响胚胎的发育及胎盘的功能。但取样的失败可导致胚胎丢失而终止妊娠。

绒毛取样前者首先要检查阴道分泌物以判别阴道的洁净度，防止取样导致宫内感染。其次需做B超检查，一是确定胚胎大小，二是确定胚芽有无心血管搏动，三是确定胚芽在子宫内的位置，用以判别取材时间，是否取材及取样器进宫的角度及深度。

1、 实验材料

妇科阴道冲洗物品、绒毛取样器、5ml注射器、培养皿、小镊子、5ml离心管、甲酸、柠檬酸钠、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、载玻片等。

2、 培养液配制

PRMI 1640 10-15ml

秋水仙素10ug/ml 1ml

3、 操作过程

（1）1‰新洁而灭冲洗阴道，用卵圆钳固定子宫颈，根据妇查及B超提示选择角度及深度试探性插入绒毛取样器，当有弹性阻挡感且深度符合B超所示时，抽出取样器内芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此时，注射器内可见有血性液体流进；

（2）取一干净培养皿，内加PRNI 1640 5ml，内含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取样器，将所吸出物注入培养皿内，并用1640冲洗注射器及取样器，混匀。置培养箱30-40分钟；

（3）挑选发育良好的绒毛放入另一小培养皿中，用预温37℃的0.075MKCL与10%柠檬酸钠1∶1混合液漂洗两次。

（4）用眼科小剪剪碎绒毛，再将2滴秋碱加入上述漂洗低渗液低渗30分钟；

（5）加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml，预固定，1000rpm8分钟，弃上清液；

（6）加新鲜配制的3∶2固定液3ml；固定30分钟，2000rpm8分钟，弃上清液；

（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分钟，2000rpm8分钟，弃上清液；

（8）离心后，加所余体积的60%冰乙酸，打匀，2分钟后加等量甲醇，打匀，2000rpm8分钟，弃上清液。

（9）3ml 3∶1甲醇冰乙酸固定液过夜，冰水制片；

（10）80℃烤片2小时，自然冷却。

（11）G分带处理，观片。

八、羊水细胞培养

羊水中含有胎儿脱落的上皮细胞，可在体外培养用以分析胎儿染色体核型。目前国内外大都采用腹腔羊膜穿刺术，妊娠12-30周的羊水细胞均可培养成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色体分析，最佳孕周为16周左右。因此时羊水增长快，羊水中细胞较多，细胞培养易于生长，而且不易损伤胎儿。国内多数选择的穿刺时间在妊娠的第16-30周。国外现已较多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠时间大致计算（1ml/w）。资料表明，穿刺病例的妊娠结局、分娩方式、胎儿的出生体重等与未穿刺无明显差异。

1、实验材料

2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签和棉球、镊子、20-22号无菌腰穿针、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培养皿、盖玻片等。

2、培养液配制

F-12 85%

小牛血清 15%

双抗 100u/ml

小瓶贮藏 4-8℃

3、操作过程

A（盖玻片培养法）

（1）采样：选择妊娠13-14周妇女，在无菌条件下抽取羊水5ml，立即注入无菌离心管中；

（2）收集：离心分离细胞，1000rpm10分钟，去上清，留0.5ml，轻打混匀；

（3）接种：30mm培养皿中放盖玻片1张，每片滴混匀的细胞液1-2滴，置培养箱内培养30-60分钟；

（4）培养：取出后从盖玻片外加培养液2ml，静置培养48小时后观察细胞生殖状况并定时换液，5-10天后，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；

（5）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小时；

（6）低渗：倒掉培养液，加预温37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃温育30分钟，镜下可见胀大的羊水细胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液预固定；

（7）固定：倒掉低渗液，加5ml固定液固定30分钟以上，反复3次；

（8）干燥：将附有细胞的盖玻片斜放于培养皿中，置80℃烤箱处理2-3小时；

（9）胶片：将附有细胞的盖玻片用树脂胶封固于玻片上，正面朝外，小心细胞破坏；

B（常规培养法）

（1）-（2）相同于盖玻片培养法；

（3）接种：将混匀的羊水细胞种置于50ml或100ml细胞培养瓶内，平均10ml羊水细胞收集的细胞种置一瓶加5-10ml混合培养液。

（4）培养：酒精灯火先封口，静置培养48小时后观察细胞贴壁及生长情况，5-10天后可见瓶底面有大量羊水细胞生长；

（5）终止培养：同A法；

（6）细胞收集：将培养液倒入一干净离心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，轻轻摇动，使培养瓶底面完全接触消化酶，然后用弯头吸管吹打，待细胞全部脱落后加前培养液终止胰蛋白酶消化。用吸管移细胞悬液于离心管中。1000-2000rpm10分钟，弃上清，留细胞沉虑。若一次消化不彻底，可反复消化；

（7）低渗及预固定：加预温37℃KCL溶液10ml，37℃温育30分钟，加0.5-1ml新鲜配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液预固定，用气泡吹打细胞使其混匀。

（8）固定：用新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液固定三次，每次30分钟。固定液加入时沿管壁缓慢加入；

（9）制片及干燥：用绒毛制片；

（10）分带处理。

编辑: helen

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