提高PCR反应的灵敏度的方法

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发布日期：2011-11-28 18:09 文章来源：杭州朗基
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灵敏度

PCR反应

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PCR反应的灵敏度是指每个PCR反应管能检测到的最低靶分子数CFU或每微升反应液能检测到的靶分子浓度ng/ul。理论上，每个PCR反应管最低可检测出单个拷贝的靶基因，但受到提取的DNA模板的PCR反应干扰物质的影响、核酸染料的灵敏度的影响等因素，实际能检测到扩增产物所需的靶分子数往往较高。

提高PCR反应的灵敏度的方法：

1. 向反应混合物中添加低浓度的dimethyl sulphoxide（二甲基亚砜），可以扩增出原来不能扩增的靶DNA或允许更长的靶DNA更有效的扩增。

2. 添加20%的甘油能扩增长度达2500bp的靶DNA。

3. 通过热启动Hot Start方法提高反应的特异性，降低同靶DNA竞争的非特异性产物的产生，从而提高灵敏度。

PCR反应物靶基因拷贝数的计算：

对于单拷贝的基因，拷贝数＝加入反应管中的细胞数/细菌数；

能够容易分开的的细菌数目可通过血球计数板在显微镜下计数；

具有荚膜或黏液，相互间不能分开的细菌，可通过梯度系列稀释、涂布于培养平版，经培养后计数生长出的菌落数而换算出来。

对于多拷贝的基因，拷贝数＝加入反应管中的细胞数（细菌数）×单细胞（单细菌）基因组含有的基因拷贝数；

编辑: cq

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