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样品冷却保护技术SCP---Sample Cooling Protection

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发布日期：2011-11-30 13:24 文章来源：杭州朗基
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关键词： 丁香园 生物专题 杭州朗基 SCP 样品冷却保护技术 　 点击次数：

通常使用的DNA聚合酶（如Taq酶）的最适活性温度在60-80℃之间，但DNA聚合酶在低于最适活性温度时仍有部分活性，可催化PCR反应。在开始第一轮PCR反应之前，在引物的最适退火温度以下，引物除了与模板链上的同源互补区发生特异性结合外，还可与基因组DNA上潜在的高同源性区域结合或者通过布朗运动与DNA碰撞后随机结合。温度较低时，这些非特异性结合产生的短的双链结构解离的比较慢，这段短的双链区促使聚合酶结合上去并开始催化新链的合成，从而引起错误引发（mispriming），产生非特异性产物。非特异性产物一旦产生，在后续的循环中即可作为新链合成的模板，发生指数扩增，并在扩增中同目标模板竞争dNTP、Mg离子、酶和引物等成分，最终导致产物的量减少和更多非特异性产物的产生。另外，当温度较低时，引物通过相互间互补序列的碱基配对形成的二聚体更稳定，扩增后会产生更多的引物二聚体，并降低后续反应可用的引物浓度。

为减少DNA聚合酶在低温下的催化活性，科研人员通常会有意识的在配置PCR反应液的过程中维持低温环境，例如将反应预混液放置在冰上；而将PCR管放在PCR仪开始运行PCR程序时，热盖需要一段时间（通常需要3.5分钟）才能从常温（25℃）升温到预设温度（如105℃）。随着热盖升温，样品台和PCR管也会缓慢升温，由于传热效应导致PCR反应液温度逐渐升高；如果在一次PCR试验过后，未等样品台完全冷却，接着进行第二次试验，热盖升温过程中，样品台和PCR管会维持更高的温度，所以在热盖升温过程中由于DNA聚合酶的催化活性引起错误引发而可能会产生非特异性产物。

通过手动热启动方法可减少在热盖预热过程中，由于反应液升温造成的非特异反应的发生。手动热启动时，可以将配置好的PCR反应预混液放在冰上，运行PCR程序，待热盖预热并升温到80℃以上或样品台达到变性温度时，再将PCR管放入PCR仪，开始反应。但是这种办法显然比较麻烦，而且当所用的PCR管较多（10个以上），样品量又较大（25ul以上），在将这些管子一一放在样品台上时，由于没有热盖的保护作用，一部分PCR管中的液体已经开始蒸发，甚至涨开管盖，导致反应液的损失和交叉污染的发生。

使用热启动DNA聚合酶可更好的防止由于DNA聚合酶在低温下的催化活性造成的问题，这种酶通过化学修饰或通过与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。但是这些酶的价格往往较高，短期内无法完全普及。

通过采用SCP技术后，热盖在升温过程中，样品台能一直维持在室温以下（20℃），直到热盖升温到设定温度（如105℃），样品台才开始升温并开始运行预设的PCR程序，这就避免了在PCR程序开始前，由于反应液温度的被动升高所带来的非特异性扩增的发生。采用SCP技术后，用户无需再等待热盖预热后再将PCR管放入仪器反应。

总之，采用SCP技术，可在一定程度上减少非特异性反应的发生，简化了用户的手动热启动操作，节省了购买热启动DNA聚合酶的花费；当然，SCP技术可结合使用热启动DNA聚合酶，以达到更好的防止非特异性反应的效果，同时SCP技术不会对热启动DNA聚合酶的使用和活性带来任何影响。

编辑: cq

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