环境微生物群落多样性分析
在环境微生物生态学的发展过程中，有三个进展是至关重要的：一、分子技术在该领域的应用，克服了自然界微生物纯培养的局限，大大扩展了我们在整体上对自然环境微生物的认知范围；二、将宏观生态的思想和方法引入微生物生态研究，极大地提高了我们对微生物多样性的认知水平；三、第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。
Roche 454测序技术优势
1. 测序序列长，可以覆盖16S /18S rDNA、ITS等高变区域。
2. 测序通量高，可以检测到环境样品中的痕量微生物。
3. 实验操作简单、结果稳定，可重复性强。
4. 无需进行复杂的文库构建，微生物DNA扩增产物可以直接进行测序，实验周期短。
5. 测序数据便于进行生物信息分析。
技术路线
扩增区域选择
1. 细菌扩增区域 （16S rDNA）
1) 一般选择V3区和V6区。
2) 其它备选区域：V1+V2、V2、V4、V5+V6、V6+V7
3) 引物设计参考：
| 区域 | 通用引物 |
| V1+V2 | 8F-338R |
| V2 | 27F-338R |
| V3 | 341F-534R |
| V4 | 530F-805R |
| V5+V6 | 805F-1046R |
| V6 | 967F-1046R |
| V6+V7 | 967F-1220R |
2. 真菌扩增区域
1) 一般选择： V4、V9、ITS
2) 引物设计参考：
| 区域 | 通用引物 |
| V4 | 528F-706R |
| V9 | 1380F-1510R |
| ITS | ITS1F-ITS2 |
| SSU | NF1-18Sr2b |
| LSU | D3A-D3B |
多样本平行测序
1. 多个环境样品可以同时进行高通量深度测序。
2. 样品之间的测序数据通过扩增时引入的标签（tag）进行区分。
3. 美吉生物开发出了一套稳定的多样本平行测序实验方案。
4. 美吉生物提供的tag序列均经过Roche和美吉生物的实验检验。
5. 多样本平行测序成功的关键是样品间的测序数据量趋于一致。美吉生物拥有样品间数据量不平衡问题的解决方案。
6. 美吉生物可以帮合作伙伴实现200个样品的平行测序。
环境样品测序深度
1. 不同环境样品中微生物的丰富度差别很大，所需的测序深度也不同。
2. 研究目的决定了环境微生物的检测精度，而检测精度决定了测序深度。
3. 美吉生物针对不同的环境样品和研究目的，建立了环境样品测序深度数据库，可以为合作伙伴提供检索。
定向测序
1. 美吉生物设计的实验方案可以实现PCR产物的定向测序。
2. 定向测序技术避免了非定向测序造成的数据冗余，充分利用了每条有效测序序列，且便于后期的菌群分类处理。
3. 定向测序能为合作伙伴节省454文库构建的费用。
4. 扩增引物的合成质量是定向测序成败的关键。
生物信息分析
1. 数据统计分析
1) 有效测序数据统计
2) 可供精准分析的数据产量统计
2. 数据回归样品
1) 根据tag信息将测序数据回归各自样品
编辑: helen
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