基因操作工具-慢病毒
重组慢病毒简介、安全操作规范
重组慢病毒简介
在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中，重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具(Ausubel et al., 1995; Coffin et al., 1996)。慢病毒能作用于细胞周期的G0/G1期，同时具有嗜核性，所以可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞，感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞。慢病毒载体还具有转移的基因片段容量较大（9 kb）、目的基因可整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点。所以获得了较广的应用范围。
慢病毒载体也是RNAi表达的主要手段（Sachdeva et al., 2007），同化学合成和酶切形成的siRNA相比具有几个优点：其一，可以携带GFP或萤光素酶等报告基因共表达，便于跟踪、选择和富集转染的细胞；其二，可以根据需要表达不同类型的小RNA分子（siRNA、shRNA或miRNA）；其三，具有较高的转染效率，使基因沉默维持较长时间（Li MJ et al., 2003）。
目前Pubmed中收录有关慢病毒载体用作实验的文章超过7万多篇，仅Nature,，Science,，Cell上便超过600篇。已成为国际上最通用的转染系统，广泛用于各类实验室。
慢病毒的安全操作规范
上海生博提供的慢病毒均采用第二代系统的慢病毒载体。水泡性口炎病毒来源的VSV-G基因代替HIV-1的env基因，这既提高了慢病毒的安全性，又使其能够感染的细胞种类大大增加。
本系统的慢病毒颗粒是“自身失活型(SIV)”，整合入靶细胞后，不会产生完整长度的RNA，仅仅具有携带目的基因的功能，感染目的细胞后不再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。
尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险性，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假性病毒；并强烈建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，而且严格遵守BSL-2或BSL-2+操作手册并进行相应的废弃物消毒。基本操作规范如下：
1. 在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服；应戴上合适的手套和口罩。
2. 病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通的超净工作台操作病毒，请不要打开风机。
3. 所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。如果出现病毒污染，请立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干净。
4. 如需离心，应使用密封性好的离心管，可用Parafilm膜封口后离心，而且最好使用组织或细胞培养室内的离心机。
5. 用显微镜观察细胞感染情况时用遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，并在使用70%乙醇清理所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须清除污染。废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）。
6. 手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。
详细操作规范请参阅卫生部发布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）、美国疾病控制中心出版的《微生物和生物医学实验生物安全（第五版）》和世界卫生组织出版《WHO生物安全手册》。操作慢病毒时请依照现有的使用指南。
包装细胞293T细胞的培养
（下述流程来自上海生博Lenti-Center，如果使用不同公司系统请参考各公司提供的方案，本流程仅供参考）
一、293T细胞的冻存
1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代
1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏
1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
编辑: cq
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