基因操作工具-腺病毒
腺病毒的安全操作规范
上海生博提供的腺病毒颗粒均采用改造的AdMax系统包装，采用的腺病毒载体是一种E1及E3区缺失的缺陷型病毒载体，除了293细胞等能反式提供E1蛋白的细胞株外，它们在其它的细胞当中都无法复制。NIH指出所有人血清型腺病毒都被划分为BL-2级，所有属于BL-2级的样品都被认为具有一般性的潜在危害。因此要严格遵从NIH推荐的安全指南来处理各种携带BL-2级生物的样品。
使用橡胶手套，使用带滤芯的枪头，戴生物安全帽操作实验。所生产的腺病毒只能用于科学研究，不能用于诊断和治疗。
参考更多生物安全标准信息，您可以从http://bmbl.od.nih.gov/获得。
基本操作规范如下：
1. 在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服；应戴上合适的手套和口罩。
2. 病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通的超净工作台操作病毒，请不要打开风机。
3. 所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。如果出现病毒污染，请立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干净。
4. 如需离心，应使用密封性好的离心管，可用Parafilm膜封口后离心，而且最好使用组织或细胞培养室内的离心机。
5. 用显微镜观察细胞感染情况时用遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，并在使用70%乙醇清理瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜试验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。
6. 所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须清除污染。废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）。
7. 手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。
详细操作规范请参阅卫生部发布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）、美国疾病控制中心出版的《微生物和生物医学实验生物安全（第五版）》和世界卫生组织出版《WHO生物安全手册》。操作腺病毒时请依照现有的使用指南。
包装细胞HEK293细胞的培养
（下述流程来自上海生博Ad-Center，如果使用不同公司系统请参考各公司提供的方案，本流程仅供参考）
HEK293细胞的冻存
1. 随着传代的次数增加，HEK293细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性,由其包装实验选择的HEK293细胞一定要低代次、状态佳。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。
HEK293细胞的传代
1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
HEK293细胞的复苏
1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
腺病毒的包装、纯化和滴度测定
用于包装的HEK293细胞的培养
用于包装的HEK293细胞(ATCC No. CRL-1573)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
腺病毒的包装（以10cm培养板为例）：
1. 转染前一天，将细胞接种10cm细胞培养器皿中，控制细胞转染时的密度为70-90%。
2. 转染前一小时取出细胞培养器皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
编辑: cq
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