基因操作工具-腺病毒
生博腺病毒滴度检测试剂盒
上海生博独立开发的腺病毒滴度检测试剂盒AdTiter-EZ，可以使您在2.5天内获得准确的腺病毒滴度（单位：IFU），操作简单，即使您是初次试验者也能够准确测得病毒滴度。
腺病毒的储存与稀释
腺病毒的储存
1. 若病毒量较大，需长期保存，必须在-80℃，特别是从培养介质中纯化之后。在最佳的缓冲液（10mM Tris HCl pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4% sucrose）病毒会持续1-2年稳定性，一般超过6个月后使用，应该重新检测病毒滴度。避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度10%。建议不要在-20℃下长期保存。
2. 在DMEM中用血清保存的方式与纯化颗粒一致，但由于血清保护通常比在缓冲液中更加稳定。可以在DMEM中用血清在4℃存储病毒一周以上而不需要反复冻融。
3. 病毒的运输采用4°运输，收到病毒液后若几天内用于实验，可分装部分于4℃保存（于一周内用完）。
4. 在邮寄病毒时，建议不要直接放于干冰中的方式递送，而用水冰代替，因为干冰所造成的低温气体环境会大大降低缓冲液的pH值，从而极大影响腺病毒在缓冲液中的稳定性。
腺病毒的稀释
需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank's、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（于一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，并尽快用完。
腺病毒在细胞水平的使用
什么是MOI？
“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）。在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。
MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定腺病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体（in vivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。
什么是VP、PFU、IU?
不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）
VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性） 和 “死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。
PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的 “活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。
IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。
VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽
目的细胞感染预实验及实验体系的放大
1. 实验目的：确定细胞感染所需的MOI。
2. 实验材料：96孔板，1.5ml EP管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的腺病毒溶液，目的细胞培养基等。
3. 第一天：细胞准备
将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3×10(4-5)×104个/ml，按90μl/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间。
4. 第二天：病毒感染
病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1（细胞经过一天的生长数量约为1×104个/孔，对应的病毒数量为1×1046PFU、1×105PFU和1×104PFU）。加入相应病毒量后，中间每隔15-20min摇晃一次培养板，增加感染效果。
5. 第二天：换液
感染实验同一天，1.5-2小时，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔。 (注：某些特殊细胞需要更换一半病毒液后，过夜，具体请咨询公司技术支持信箱：sunbio_techservice@sbo-bio.com.cn
6. 第三天：观察荧光表达情况
在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计腺病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟一天观察的时间，以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染最佳MOI。对于因目的基因较大，载体无法携带标志基因的，细胞感染腺病毒后48h后蛋白表达达到峰值，可以通过荧光定量PCR或者WB来检测目的基因的表达来评估感染效率。
7. 实验体系的放大
正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大。放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度较大，可进行对MOI的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。
表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值
| 单孔底面积（cm2） | 正常培养体积（μl） | 感染时体积（μl） | MOI=1 病毒量（PFU） | MOI=10 病毒量（PFU） | MOI=100病毒量（PFU） | |
| 96孔板 | 0.3 | 100 | 100 | 1×104 | 1×105 | 1×106 |
| 48孔板 | 0.6 | 200 | 200 | 2×104 | 2×105 | 2×106 |
| 24孔板 | 1.9 | 500 | 500 | 6×104 | 6×105 | 6×106 |
| 12孔板 | 3.8 | 1000 | 500 | 1×105 | 1×106 | 1×107 |
| 6孔板 | 9.5 | 2000 | 1000 | 2×105 | 2×106 | 2×107 |
| T25瓶 | 25 | 5000 | 2500 | 5×105 | 5×106 | 5×107 |
*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。
*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如Ad-CMV-β-gal 或者 Ad-CMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过β-gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表型变化否的病毒浓度范围。
我们已经针对多种细胞系做了预实验，加入已混合病毒的培养基，6-8小时或者过夜。对于大多数细胞系来说，当病毒浓度在2 × 105 - 1 × 106 PFU／ml的条件下，基本上都能得到10%以上的感染效率而且不会有副作用。我们推荐在您的实验系统中，使用含有报告基因的病毒摸索一下最佳用量。
腺病毒在整体动物水平的使用
用于体内试验的腺病毒，纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。
腺病毒用量范围在108-9PFU/只小鼠，每隔一天注射一次，共注射4次。小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCD鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡。
由于腺病毒在整体动物实验的复杂性和多样性，请直接将您的问题和建议与我们的动物工程师讨论，上海生博动物中心的腺病毒技术工程师也愿意与您分享他们在这一领域的经验，联系电话021-50793722电子邮件sunbio_techservice@sbo-bio.com.cn
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